猪源菊粉酶产生菌的分离及鉴定
1利用含菊粉的基础培养基从猪盲肠和结肠新鲜食糜中分离出猪源菊粉酶产生菌，分离得到5株猪源菊粉酶产生菌，其中盲肠分离到为2株，分别命名为M1、M2；结肠分离到3株，分别命名为J1、J2、J3。根据形态鉴定、生理生化特征及分子生物学鉴定，将J1和M1确立为解没食子酸链球菌（Streptococcus gallolyticus），菌株J2确立为巴黎链球菌（Streptococcus lutetiensis），菌株J3与M2确立为马链球菌（Streptococcus equinus）。通过体外培养的方法，研究了3种菌株以不同碳源（低聚果糖、菊粉和葡萄糖）为底物的生长情况。结果显示，体外发酵24 h后，J1（M1）和J3（M2）对葡萄糖的利用程度大于低聚果糖组和菊粉组，而J2菊粉组的总挥发性脂肪酸和乙酸浓度显著高于低聚果糖组和葡萄糖组（P<0.05），且J2菊粉组的总挥发酸浓度显著高于J1（M1）菊粉组和J3（M2）菊粉组（P<0.05）。综上所述，菌株J2对菊粉的利用效果最佳。
目录
引言
在现代化养猪生产中，由于断奶、换料等造成的仔猪腹泻常通过抗生素减缓，随着饲用抗生素添加的规范，仔猪腹泻将面临更严重的挑战。菊粉是由D呋喃果糖分子以β(2,1)糖苷键连接而成的果聚糖，是一种无耐药、无残留的纯天然抗生素替代品[1]。但菊粉在断奶仔猪饲料中的使用并不广泛，这可能与仔猪肠道菌群发育较慢，菊粉降解菌群少，不能利用菊粉建立有益肠道菌群有关。许多研究结果表明，人和动物不能分泌水解菊粉的β果糖苷酶，菊粉在单胃动物的胃和小肠很难被消化吸收，大部分能够以完整的形式到达大肠，在大肠中发酵，选择性地促进乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌的增殖，肠道中的有益菌通过在肠道内的定植来抑制大肠杆菌等有害菌的增殖[24]。
现在已知的菊粉酶产生菌包括真菌、酵母和细菌。根据目前的报道，产菊粉酶的丝状真菌有：青霉菌属（Penicillium sp.914，P.rugulosum，P.purpurogenumvar rubisclerotium，P.trzebinskii），曲霉菌曲霉属（Aspergillus awamori 808，A.aureus MTCC 151，A.niger MTCC281，A.fischeri MTCC 150，A.Nidulans， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
A.niger MTCC 281，A.niger 817，A. niger
A42，A.niger mutant UV1，A.niger mutant 817），镰刀菌属（Fusarium oxysporum NCIM
，金孢子菌属（Chrysosporium pannorum）。
酵母菌有：克鲁维酵母属（Kluyveromyces marxianus，K. marxianus ATCC 52466，K. marxianus ATCC 36907，K. marxianus CBS 6556，K. Marxianus var.marxianus CBS 6556，K.marxianus UCD 5528，K.marxianus CDBBLL278，K.fragilis CCY 5114，K. fragilis ATCC 12424，K. lactis），假丝酵母属（Candida pseudotropicalis IP513，C.kefyr DSM 70106），毕赤酵母属（Pichia sp.）。
细菌有：葡萄球菌属（Staphylococcus sp.），芽孢杆菌属（Bacillus sp），节杆菌属（Arthrobacter sp.），醋酸杆菌属（Acetobacter sp.），梭杆菌属（Clostridium acetobutylicum IFP 912），埃希氏菌属（Escherichia coli），黄杆菌属（Flavobactrium mulivorum），假单细胞菌属（Pseudomonas sp.65），链霉菌属（Streptomycesrochei E87）[56]。
目前国内外很多研究者致力于新的产菊粉酶菌株的筛选，但国内从动物消化道分离产菊粉酶的菌株的研究比较缺乏，现在仅能了解到能利用菊粉的消化道微生物为双歧杆菌和乳酸杆菌。但Nilsson等研究发现，菊粉在大肠内被微生物发酵，发酵的终产物主要为VFA（乙酸、丙酸、丁酸），气体（CO2、H2、CH4、H2S）和有机酸（乳酸、琥珀酸、丙酮酸等）[7]。双歧杆菌和乳酸杆菌不能产生H2、H2S，可见除这两种菌外，还有其它一些有待于进一步研究的微生物可以利用菊粉。有研究发现，链球菌属（Streptococcus）内的某些细菌具有产生菊粉酶的能力[8]。秦宁等证明，将菊粉作为单一碳源的培养基对嗜热链球菌具有增菌的作用[9]。本文从猪盲肠和结肠食糜中分离出了3株具有产菊粉酶功能的链球菌，为菊粉在养猪生产中的应用提供更多途径及研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 接种物
分别取四头杜×长×大育肥猪回肠、盲肠和结肠各段食糜50 g于培养皿中,称重后按照1:9的比例用预热后的PBS稀释、混匀。将混合液用四层无菌纱布过滤到灭菌的发酵瓶中,用橡胶塞塞紧，并打上铝盖。然后置于37 ℃水浴锅中,待接种时使用。以上所有步骤均在持续通入CO2气流条件下进行。
1.1.2 培养基
基础培养基配制方法：根据戴兆来[10]方法配制，稍作改良。将0.6 g KCl，0.6 g NaCl，0.2 g CaCl22H2O，0.5 g MgSO47H2O，1.46 g KH2PO4，3.55 g Na2HPO4，5 g菊粉溶于920 mL煮沸过的去离子水中，再加入1 mL刃天青溶液，10 mL微量矿物质溶液，10 mL氯高铁血红素溶液和10 mL脂肪酸溶液。混匀后放入微波炉中加热至沸腾，通CO2至常温。再加入50 mL碳酸盐缓冲液，CO2通气46 h。在有持续CO2气流通气的条件下，将培养基分装到滚管中，每管9.3 mL，用橡胶塞密封，打盖，115 ℃灭菌20 min。待管内液体冷却之后，用无菌注射器分别加入0.1 mL己过滤灭菌的维生素盐酸盐溶液和还原剂。
刃天青溶液配制方法：称取100 mg刃天青溶于100 mL水。有游离氧存在时呈红色，厌氧时呈无色，为本实验厌氧指示剂。
微量矿物质溶液配制方法：将25 mg MnCL24H2O，20 mg FeSO47H2O，25 mg ZnCl2，50 mg CuCl22H2O，50 mg CoCl26H2O，50 mg SeO2，250 mg NiCl26H2O，250 mg Na2MoO42H2O，31.4 mg NaVO3，250 mg H3BO3，按顺序依次溶解在20 mL 0.02 mol/L HCl中，加水定容到1 L，分装、保存于500 mL棕色瓶。
氯高铁血红素溶液配制方法：称取0.1 g氯高铁血红素溶于5 ml 0.05 mol/L NaOH溶液，用煮沸过的持续通入CO2的水定容至500 mL。
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引言
在现代化养猪生产中，由于断奶、换料等造成的仔猪腹泻常通过抗生素减缓，随着饲用抗生素添加的规范，仔猪腹泻将面临更严重的挑战。菊粉是由D呋喃果糖分子以β(2,1)糖苷键连接而成的果聚糖，是一种无耐药、无残留的纯天然抗生素替代品[1]。但菊粉在断奶仔猪饲料中的使用并不广泛，这可能与仔猪肠道菌群发育较慢，菊粉降解菌群少，不能利用菊粉建立有益肠道菌群有关。许多研究结果表明，人和动物不能分泌水解菊粉的β果糖苷酶，菊粉在单胃动物的胃和小肠很难被消化吸收，大部分能够以完整的形式到达大肠，在大肠中发酵，选择性地促进乳酸杆菌、双歧杆菌等有益菌的增殖，肠道中的有益菌通过在肠道内的定植来抑制大肠杆菌等有害菌的增殖[24]。
现在已知的菊粉酶产生菌包括真菌、酵母和细菌。根据目前的报道，产菊粉酶的丝状真菌有：青霉菌属（Penicillium sp.914，P.rugulosum，P.purpurogenumvar rubisclerotium，P.trzebinskii），曲霉菌曲霉属（Aspergillus awamori 808，A.aureus MTCC 151，A.niger MTCC281，A.fischeri MTCC 150，A.Nidulans， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
A.niger MTCC 281，A.niger 817，A. niger
A42，A.niger mutant UV1，A.niger mutant 817），镰刀菌属（Fusarium oxysporum NCIM
，金孢子菌属（Chrysosporium pannorum）。
酵母菌有：克鲁维酵母属（Kluyveromyces marxianus，K. marxianus ATCC 52466，K. marxianus ATCC 36907，K. marxianus CBS 6556，K. Marxianus var.marxianus CBS 6556，K.marxianus UCD 5528，K.marxianus CDBBLL278，K.fragilis CCY 5114，K. fragilis ATCC 12424，K. lactis），假丝酵母属（Candida pseudotropicalis IP513，C.kefyr DSM 70106），毕赤酵母属（Pichia sp.）。
细菌有：葡萄球菌属（Staphylococcus sp.），芽孢杆菌属（Bacillus sp），节杆菌属（Arthrobacter sp.），醋酸杆菌属（Acetobacter sp.），梭杆菌属（Clostridium acetobutylicum IFP 912），埃希氏菌属（Escherichia coli），黄杆菌属（Flavobactrium mulivorum），假单细胞菌属（Pseudomonas sp.65），链霉菌属（Streptomycesrochei E87）[56]。
目前国内外很多研究者致力于新的产菊粉酶菌株的筛选，但国内从动物消化道分离产菊粉酶的菌株的研究比较缺乏，现在仅能了解到能利用菊粉的消化道微生物为双歧杆菌和乳酸杆菌。但Nilsson等研究发现，菊粉在大肠内被微生物发酵，发酵的终产物主要为VFA（乙酸、丙酸、丁酸），气体（CO2、H2、CH4、H2S）和有机酸（乳酸、琥珀酸、丙酮酸等）[7]。双歧杆菌和乳酸杆菌不能产生H2、H2S，可见除这两种菌外，还有其它一些有待于进一步研究的微生物可以利用菊粉。有研究发现，链球菌属（Streptococcus）内的某些细菌具有产生菊粉酶的能力[8]。秦宁等证明，将菊粉作为单一碳源的培养基对嗜热链球菌具有增菌的作用[9]。本文从猪盲肠和结肠食糜中分离出了3株具有产菊粉酶功能的链球菌，为菊粉在养猪生产中的应用提供更多途径及研究基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 接种物
分别取四头杜×长×大育肥猪回肠、盲肠和结肠各段食糜50 g于培养皿中,称重后按照1:9的比例用预热后的PBS稀释、混匀。将混合液用四层无菌纱布过滤到灭菌的发酵瓶中,用橡胶塞塞紧，并打上铝盖。然后置于37 ℃水浴锅中,待接种时使用。以上所有步骤均在持续通入CO2气流条件下进行。
1.1.2 培养基
基础培养基配制方法：根据戴兆来[10]方法配制，稍作改良。将0.6 g KCl，0.6 g NaCl，0.2 g CaCl22H2O，0.5 g MgSO47H2O，1.46 g KH2PO4，3.55 g Na2HPO4，5 g菊粉溶于920 mL煮沸过的去离子水中，再加入1 mL刃天青溶液，10 mL微量矿物质溶液，10 mL氯高铁血红素溶液和10 mL脂肪酸溶液。混匀后放入微波炉中加热至沸腾，通CO2至常温。再加入50 mL碳酸盐缓冲液，CO2通气46 h。在有持续CO2气流通气的条件下，将培养基分装到滚管中，每管9.3 mL，用橡胶塞密封，打盖，115 ℃灭菌20 min。待管内液体冷却之后，用无菌注射器分别加入0.1 mL己过滤灭菌的维生素盐酸盐溶液和还原剂。
刃天青溶液配制方法：称取100 mg刃天青溶于100 mL水。有游离氧存在时呈红色，厌氧时呈无色，为本实验厌氧指示剂。
微量矿物质溶液配制方法：将25 mg MnCL24H2O，20 mg FeSO47H2O，25 mg ZnCl2，50 mg CuCl22H2O，50 mg CoCl26H2O，50 mg SeO2，250 mg NiCl26H2O，250 mg Na2MoO42H2O，31.4 mg NaVO3，250 mg H3BO3，按顺序依次溶解在20 mL 0.02 mol/L HCl中，加水定容到1 L，分装、保存于500 mL棕色瓶。
氯高铁血红素溶液配制方法：称取0.1 g氯高铁血红素溶于5 ml 0.05 mol/L NaOH溶液，用煮沸过的持续通入CO2的水定容至500 mL。
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