塑化剂对卵子质量的毒性作用
塑化剂，作为可提高材料柔软程度或使材料液化的一种添加剂。目前，塑化剂已被证明会对动物的生殖系统产生影响，但有关于其对雌性生殖系统发育的影响还研究较少。本实验检测了塑化剂的主要体内代谢产物邻苯二甲酸单（2-乙基己基）酯[mono-(2-ethylhexyl)phthalate，MEHP]对猪卵子发育以及其质量的影响，首先用MEHP处理卵母细胞，观察其颗粒细胞扩散情况与极体排出率，之后采用荧光染色技术检测其细胞的氧化应激与早期凋亡的情况。结果表明，极体排出率在用100μM MEHP 处理时并无明显变化，但在用125μM和150μM的MEHP处理时则显著下降，颗粒细胞的扩散也受到了抑制；与对照组相比,卵子的ROS水平与早期凋亡的情况在MEHP处理后显著上升。综上，本实验证明了塑化剂通过影响ROS和早期凋亡来影响卵子的成熟。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 抗体和试剂2
1.2 主要仪器设备 3
1.3 猪卵母细胞分离与成熟培养3
1.4 MEHP处理卵母细胞3
1.5 荧光染色3
1.5.1 氧化应激的荧光染色3
1.5.2 早期凋亡的荧光染色4
1.6 数据分析4
2 结果与分析4
2.1 MEHP对于卵母细胞极体排出率的影响4
2.2 MEHP处理导致卵母细胞发生氧化应激5
2.3 MEHP处理导致卵母细胞发生早期凋亡6
3 讨论7
4 小结8
致谢8
参考文献 9
塑化剂对卵子质量的毒性作用
引言
引言
作为助剂的一种，塑化剂广泛的应用于化妆品、水泥、石膏以及洗涤产品的材料中，尤其是在聚乙烯塑料制品当中[1]。但由于其自身带有一定的危害，不能够作为食品添加剂使用，否则会影响人类以及家禽家畜的健康。塑化剂在大分子链之间分布，可以降低分子间作用力，降低聚合物的粘度，并增强柔韧性。但是塑化剂中的邻苯二甲酸酯类化合物，一般为低熔点固体或无 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
色油状黏稠液体，难挥发，沸点高，具有较低的蒸气压和凝固点，难溶于水，易溶于有机溶剂，与水比重相似，并且与塑料分子的相溶性较好，两者间的结合主要靠氢键或范德华力，彼此的化学性质保持相对独立状态[2]。因此，当使用时限增长时，邻苯二甲酸酯类物质就可从塑料制品中不断地释放出来，对环境造成污染，从而间接对人类以及家禽家畜的健康产生潜在影响。
邻苯二甲酸二（2乙基）己基酯(DEHP)是存在于塑化剂中主要的有毒物质，可经过皮肤、肺和胃肠道被机体吸收，胃肠道是目前通常认为的主要吸收途径。通过食物摄入少许DEHP(0.64mg/kg)时，DEHP在人体内吸收和分布的时期可持续约48h[3]。DEHP进入机体之后，在胰腺酶和肠道内的一些酶的作用下，转变为以邻苯二甲酸单（2乙基己基）酯(MEHP)为主的单酯。因此在肺脏、肝脏、胰腺、睾丸、肾脏和血液中DEHP都可以被水解为MEHP，部分的DEHP会在24h内经由汗液、尿液或者粪便从体内排出，而MEHP作为其主要代谢产物则会长期蓄积在人体的组织中，生物蓄积时间可长达6个月[4]。
DEHP具有很多潜在的慢性毒性，目前已通过体外细胞实验、动物实验（主要是啮齿动物）等调查方法，证明了DEHP可能引起细胞代谢紊乱、可能造成心血管系统障碍、病毒性肝病、肾功能衰竭，甚至可能致癌[5]。
塑化剂对于家畜家禽的生殖系统有着一定的不良影响。用电镜观察HE染色后的大鼠睾丸，在处理组中发现各级生精细胞产生大量的缺失，生精小管发生严重萎缩，间质细胞异常增生，支持细胞呈空泡状，细胞结构紊乱，未见精细胞，细胞核体积较大，核凹陷严重形状异常，核膜处产生切迹、不光滑，且在核膜下有核异染色质附着，细胞器数量降低，线粒体增多且形态发生改变，细胞出病变。这些结果表明，DEHP可以通过影响睾丸的超微结构来影响睾丸的正常生长，从而影响大鼠的生殖毒性[6]。
关于雌性生殖系统，已有实验证明，2000mg/kg 的DEHP可以减少大鼠雌二醇的合成，改变自然排卵周期发生，延长动情周期，并且产生不排卵的现象，同时卵泡的体积减小，并出现多囊卵巢[7]。体外培养SD大鼠卵泡实验发现，随着升高MEHP的剂量，卵泡发生轮廓不清，内部产生黑色坏死区，卵泡基底膜出现缺失、模糊不清，卵子逸出的现象[8]。MEHP浓度为80 μg/ml时可明显地抑制囊状卵泡的生长与发育[9]。100 μg/ml 的MEHP则可增加卵巢颗粒细胞的凋亡数量，降低卵泡存活率[10]。同时也可使小鼠的闭锁卵泡数提升[11]。添加雌二醇与含DEHP和MEHP 的培养液进行共同培养，可以使DEHP和MEHP对卵泡生长的抑制作用得到一定的拮抗[12]。
然而，有关塑化剂对于猪卵母细胞的危害研究还较少。本课题利用MEHP对猪卵子进行体外培养，检测卵子的颗粒细胞扩散情况、极体排出率、氧化应激水平以及早期凋亡情况，进而总结出塑化剂对于卵子质量的毒性作用。
1 材料与方法
1．1 抗体和试剂
孕马血清促性腺激素(PMSG)：宁波市第二激素厂，Lot.No：091103
人绒毛膜促性腺激素(hCG)：宁波市第二激素厂，Lot.No：111215
L半胱氨酸(cysteine)：美国SigmaAldrich公司，Cat.No：C7880
表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)：美国SigmaAldrich公司，Cat.No：E5160
青霉素钾(penicillin)：山东鲁抗医药股份有限公司，LotNo：S090615
葡萄糖(Dglucose)：美国SigmaAldrich公司，Cat.No：G7021
二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)：SigmaAldrich公司，Cat.No：D2650
组织培养基TCM199：美国SigmaAldrich公司，Cat.No：M2154
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 抗体和试剂2
1.2 主要仪器设备 3
1.3 猪卵母细胞分离与成熟培养3
1.4 MEHP处理卵母细胞3
1.5 荧光染色3
1.5.1 氧化应激的荧光染色3
1.5.2 早期凋亡的荧光染色4
1.6 数据分析4
2 结果与分析4
2.1 MEHP对于卵母细胞极体排出率的影响4
2.2 MEHP处理导致卵母细胞发生氧化应激5
2.3 MEHP处理导致卵母细胞发生早期凋亡6
3 讨论7
4 小结8
致谢8
参考文献 9
塑化剂对卵子质量的毒性作用
引言
引言
作为助剂的一种，塑化剂广泛的应用于化妆品、水泥、石膏以及洗涤产品的材料中，尤其是在聚乙烯塑料制品当中[1]。但由于其自身带有一定的危害，不能够作为食品添加剂使用，否则会影响人类以及家禽家畜的健康。塑化剂在大分子链之间分布，可以降低分子间作用力，降低聚合物的粘度，并增强柔韧性。但是塑化剂中的邻苯二甲酸酯类化合物，一般为低熔点固体或无 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
色油状黏稠液体，难挥发，沸点高，具有较低的蒸气压和凝固点，难溶于水，易溶于有机溶剂，与水比重相似，并且与塑料分子的相溶性较好，两者间的结合主要靠氢键或范德华力，彼此的化学性质保持相对独立状态[2]。因此，当使用时限增长时，邻苯二甲酸酯类物质就可从塑料制品中不断地释放出来，对环境造成污染，从而间接对人类以及家禽家畜的健康产生潜在影响。
邻苯二甲酸二（2乙基）己基酯(DEHP)是存在于塑化剂中主要的有毒物质，可经过皮肤、肺和胃肠道被机体吸收，胃肠道是目前通常认为的主要吸收途径。通过食物摄入少许DEHP(0.64mg/kg)时，DEHP在人体内吸收和分布的时期可持续约48h[3]。DEHP进入机体之后，在胰腺酶和肠道内的一些酶的作用下，转变为以邻苯二甲酸单（2乙基己基）酯(MEHP)为主的单酯。因此在肺脏、肝脏、胰腺、睾丸、肾脏和血液中DEHP都可以被水解为MEHP，部分的DEHP会在24h内经由汗液、尿液或者粪便从体内排出，而MEHP作为其主要代谢产物则会长期蓄积在人体的组织中，生物蓄积时间可长达6个月[4]。
DEHP具有很多潜在的慢性毒性，目前已通过体外细胞实验、动物实验（主要是啮齿动物）等调查方法，证明了DEHP可能引起细胞代谢紊乱、可能造成心血管系统障碍、病毒性肝病、肾功能衰竭，甚至可能致癌[5]。
塑化剂对于家畜家禽的生殖系统有着一定的不良影响。用电镜观察HE染色后的大鼠睾丸，在处理组中发现各级生精细胞产生大量的缺失，生精小管发生严重萎缩，间质细胞异常增生，支持细胞呈空泡状，细胞结构紊乱，未见精细胞，细胞核体积较大，核凹陷严重形状异常，核膜处产生切迹、不光滑，且在核膜下有核异染色质附着，细胞器数量降低，线粒体增多且形态发生改变，细胞出病变。这些结果表明，DEHP可以通过影响睾丸的超微结构来影响睾丸的正常生长，从而影响大鼠的生殖毒性[6]。
关于雌性生殖系统，已有实验证明，2000mg/kg 的DEHP可以减少大鼠雌二醇的合成，改变自然排卵周期发生，延长动情周期，并且产生不排卵的现象，同时卵泡的体积减小，并出现多囊卵巢[7]。体外培养SD大鼠卵泡实验发现，随着升高MEHP的剂量，卵泡发生轮廓不清，内部产生黑色坏死区，卵泡基底膜出现缺失、模糊不清，卵子逸出的现象[8]。MEHP浓度为80 μg/ml时可明显地抑制囊状卵泡的生长与发育[9]。100 μg/ml 的MEHP则可增加卵巢颗粒细胞的凋亡数量，降低卵泡存活率[10]。同时也可使小鼠的闭锁卵泡数提升[11]。添加雌二醇与含DEHP和MEHP 的培养液进行共同培养，可以使DEHP和MEHP对卵泡生长的抑制作用得到一定的拮抗[12]。
然而，有关塑化剂对于猪卵母细胞的危害研究还较少。本课题利用MEHP对猪卵子进行体外培养，检测卵子的颗粒细胞扩散情况、极体排出率、氧化应激水平以及早期凋亡情况，进而总结出塑化剂对于卵子质量的毒性作用。
1 材料与方法
1．1 抗体和试剂
孕马血清促性腺激素(PMSG)：宁波市第二激素厂，Lot.No：091103
人绒毛膜促性腺激素(hCG)：宁波市第二激素厂，Lot.No：111215
L半胱氨酸(cysteine)：美国SigmaAldrich公司，Cat.No：C7880
表皮生长因子(Epidermalgrowthfactor，EGF)：美国SigmaAldrich公司，Cat.No：E5160
青霉素钾(penicillin)：山东鲁抗医药股份有限公司，LotNo：S090615
葡萄糖(Dglucose)：美国SigmaAldrich公司，Cat.No：G7021
二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)：SigmaAldrich公司，Cat.No：D2650
组织培养基TCM199：美国SigmaAldrich公司，Cat.No：M2154
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