猪Six1基因不同遗传变异位点对启动子活性的影响
猪Six1基因不同遗传变异位点对启动子活性的影响[20200510205451]
摘要：Six1基因是Six基因家族成员之一，Six基因家族属于Homeobox超基因家族的成员。这些基因都具有一个保守的183个核苷酸基序，可以编码61个氨基酸的同源结构域，这个结构域可以与特异的DNA序列结合，这种特异性结合可以活化或抑制相关靶基因的转录，从而对机体的发育起调控作用。过去二十年的研究表明，Six1是一个与器官发育，以及疾病发生的调节因子，尤其在骨骼肌和肿瘤的形成中发挥重要作用。尽管如此，对Six1基因自身的转录调控机制的研究甚少。因此，本研究首先对Six1基因近端启动子中的重要SNPs位点在不同猪中进行了筛查，然后将具有不同遗传变异位点的启动子片段克隆至双荧光素酶报告载体pGL3-basic。进一步，在细胞水平利用脂质体转染试剂将含有不同遗传变异位的双荧光素酶报告载体转染细胞，并对启动子活性进行了检测。检测结果表明，Six1基因不同遗传变异位点可显著影响启动子活性，这也暗示着Six1基因在不同个体同一组织中的表达差异可能受这些变异位点的影响。通过本研究，初步阐明了Six1基因的上游转录调控机制，为更深层的解析Six1基因的转录调控机制奠定了良好的基础。
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关键字:Six1基因；不同变异位点；启动子活性；调控机制
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 主要仪器与设备 2
1.2 试验方法 2
1.2.1引物设计 2
1.2.2 PCR扩增 2
1.2.3 PCR产物纯化 3
1.2.4 pGL3-Basic和目的片段的酶切处理及连接 3
1.2.4.1酶切 3
1.2.4.2酶切产物纯化 3
1.2.4.3连接 4
1.2.5转化 4
1.2.6 单克隆菌落扩增 4
1.2.7质粒提取 4
1.2.8 转染 5
1.2.9 荧光素酶活性检测 5
1.2.10统计分析 5
2 结果与分析 5
2.1 Six1基因启动子区变异位点的鉴定与分析 5
2.2不同变异位点载体的双荧光素酶报告载体构建 6
2.3 Six1基因不同突变型载体转染C2C12细胞及活性分析 7
致谢 8
参考文献 9
猪Six1基因不同遗传变异位点对启动子活性的影响
动物科学 贺丹丹
引言
Six1基因是Six基因家族成员，在遗传进化中是一个非常保守的转录因子。Six基因家族成员都具有一个SD（110-115个氨基酸）与HD（60个氨基酸）结构域，两个结构区域都具有与特异的DNA基序结合的特性。这种特异性结合可以活化或抑制相关靶基因的转录，从而对机体的发育起调控作用。
许多研究表明，同源异型盒基因 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
Six1作为转录因子，不仅与胚胎细胞发育和器官分化有关，而且在肿瘤发生发展中发挥着重要作用[1]。Six1可调控细胞周期，诱导细胞增殖、迁移，维持细胞生存，抑制细胞凋亡。在人和小鼠上的大量研究表明，Six1基因是一个与肌肉发育紧密相关的基因。本实验室先前研究也发现，猪Six1基因在骨骼肌中的表达量要明显高于其它所检测的组织[2]。因此对Six1基因的启动子进行研究意义重大。Laclef等2003年研究发现，Six1基因敲除鼠表现出全身性的肌肉发育不全[3]，而Six1Six4双基因敲除的鼠也同样表现出普遍的肌肉发育不全，生肌决定因子myogenin与Myod1在肌刀中的表达受到严重损害[4]。进一步的研究表明，Six1基因对生肌决定因子myogenin及Myf5的调控是通过与这些重要因子启动子中的MEF3元件相互作用来实现的[5,6]。更令人感兴趣的是，Six1基因参与肌纤维形成，可通过调控快肌特异基因的表达来促进慢型肌纤维向快型肌纤维转变[7-9] 。肌纤维类型的差异是肌肉品质差异的一个重要因素，氧化型纤维（I +IIA型）（慢型肌纤维）与肉色、系水力和嫩度等呈正相关，IIB型纤维（快型肌纤维）在肌肉中所占比例的增加有助于肉产量的增加[10]，而过快的生长速率则会直接影响肌肉的品质。可以合理的推断，Six1基因很可能会影响IIB型肌纤维形成，并与猪产肉性能及肌肉品质的有着密切的联系。 然而，目前对Six1基因的上游转录调控机制的研究相对较少。本研究以Six1基因启动子区不同SNP变异位点为研究对象，探索其对Six1基因启动子活性的影响，进而初步揭示Six1基因转录表达调控机制。本实验首先对Six1基因启动子序列中的遗传变异位点在不同猪种中进行了鉴定，并构建包含不同遗传变异位点的启动子片段的双荧光素酶报告载体，进一步在细胞水平对遗传变异位点对启动子活性的影响进行检测。本研究的开展可为猪Six1基因的转录表达调控机制提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与设备
超净工作台、CO2细胞培养箱、台式冷冻离心机、超低温冰箱、微型紫外可见分光光度计、-20℃冰箱、普通PCR仪、电泳凝胶成像系统、微波炉、电泳仪、电泳槽、荧光显微镜、可调式微量移液器、千分之一电子天平、高压消毒锅、摇床、单管酶标仪
1.2 试验方法
1.2.1引物设计
从美国国家生物技术信息中心（NCBI，National Center for Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下载猪Six1基因启动子序列，然后利用Premier Primer 5软件设计扩增Six1基因近端启动子引物，基因扩增的引物信息见表1
表1 Six1基因扩增引物序列与扩增条件
引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequences (5’-3’) 退火温度Annealing Temperature (℃) 延伸时间time 长度 Size (bp)
SP3F SP3R TACCGAATCACAAATGAACCC TTTATGCAGGCGGAAAGACA 60℃ 60s 912
1.2.2 PCR扩增
以构建连有目的片段的T载体为模板，利 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
用SP3F与SP3R引物对扩增912bp片段（-736bp-+176bp）。扩增体系如下：
5×Transtart Buffer 10μL
2.5dNTP 5μL
上游引物P5-1F 2μL
下游引物P5-1R 2μL
Transtart DNA polymerase 1μL
蒸馏水 28μL
质粒 2μL
总体积50ul
以上成分于冰上添加，混匀后离心。
PCR反应条件：98℃预变性2min；98℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min10 s，32 PCR循环；72℃延伸10min。
PCR扩增产物使用含DNA green 染料的1.5%琼脂糖凝胶在含TBE缓冲液电泳槽中进行电泳，电压120伏，电泳完成后紫外灯下拍照。
1.2.3 PCR产物纯化
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl的平衡液BL，12,000 rpm(~13,400×g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。
（2）估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）。注意：如PCR反应体系为50 μl（不包括石蜡油体积）， 则加入250 μl结合液PB。
（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送测序。
1.2.8 转染
摘要：Six1基因是Six基因家族成员之一，Six基因家族属于Homeobox超基因家族的成员。这些基因都具有一个保守的183个核苷酸基序，可以编码61个氨基酸的同源结构域，这个结构域可以与特异的DNA序列结合，这种特异性结合可以活化或抑制相关靶基因的转录，从而对机体的发育起调控作用。过去二十年的研究表明，Six1是一个与器官发育，以及疾病发生的调节因子，尤其在骨骼肌和肿瘤的形成中发挥重要作用。尽管如此，对Six1基因自身的转录调控机制的研究甚少。因此，本研究首先对Six1基因近端启动子中的重要SNPs位点在不同猪中进行了筛查，然后将具有不同遗传变异位点的启动子片段克隆至双荧光素酶报告载体pGL3-basic。进一步，在细胞水平利用脂质体转染试剂将含有不同遗传变异位的双荧光素酶报告载体转染细胞，并对启动子活性进行了检测。检测结果表明，Six1基因不同遗传变异位点可显著影响启动子活性，这也暗示着Six1基因在不同个体同一组织中的表达差异可能受这些变异位点的影响。通过本研究，初步阐明了Six1基因的上游转录调控机制，为更深层的解析Six1基因的转录调控机制奠定了良好的基础。
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关键字:Six1基因；不同变异位点；启动子活性；调控机制
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
引言 2
1 材料与方法 2
1.1 主要仪器与设备 2
1.2 试验方法 2
1.2.1引物设计 2
1.2.2 PCR扩增 2
1.2.3 PCR产物纯化 3
1.2.4 pGL3-Basic和目的片段的酶切处理及连接 3
1.2.4.1酶切 3
1.2.4.2酶切产物纯化 3
1.2.4.3连接 4
1.2.5转化 4
1.2.6 单克隆菌落扩增 4
1.2.7质粒提取 4
1.2.8 转染 5
1.2.9 荧光素酶活性检测 5
1.2.10统计分析 5
2 结果与分析 5
2.1 Six1基因启动子区变异位点的鉴定与分析 5
2.2不同变异位点载体的双荧光素酶报告载体构建 6
2.3 Six1基因不同突变型载体转染C2C12细胞及活性分析 7
致谢 8
参考文献 9
猪Six1基因不同遗传变异位点对启动子活性的影响
动物科学 贺丹丹
引言
Six1基因是Six基因家族成员，在遗传进化中是一个非常保守的转录因子。Six基因家族成员都具有一个SD（110-115个氨基酸）与HD（60个氨基酸）结构域，两个结构区域都具有与特异的DNA基序结合的特性。这种特异性结合可以活化或抑制相关靶基因的转录，从而对机体的发育起调控作用。
许多研究表明，同源异型盒基因 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
Six1作为转录因子，不仅与胚胎细胞发育和器官分化有关，而且在肿瘤发生发展中发挥着重要作用[1]。Six1可调控细胞周期，诱导细胞增殖、迁移，维持细胞生存，抑制细胞凋亡。在人和小鼠上的大量研究表明，Six1基因是一个与肌肉发育紧密相关的基因。本实验室先前研究也发现，猪Six1基因在骨骼肌中的表达量要明显高于其它所检测的组织[2]。因此对Six1基因的启动子进行研究意义重大。Laclef等2003年研究发现，Six1基因敲除鼠表现出全身性的肌肉发育不全[3]，而Six1Six4双基因敲除的鼠也同样表现出普遍的肌肉发育不全，生肌决定因子myogenin与Myod1在肌刀中的表达受到严重损害[4]。进一步的研究表明，Six1基因对生肌决定因子myogenin及Myf5的调控是通过与这些重要因子启动子中的MEF3元件相互作用来实现的[5,6]。更令人感兴趣的是，Six1基因参与肌纤维形成，可通过调控快肌特异基因的表达来促进慢型肌纤维向快型肌纤维转变[7-9] 。肌纤维类型的差异是肌肉品质差异的一个重要因素，氧化型纤维（I +IIA型）（慢型肌纤维）与肉色、系水力和嫩度等呈正相关，IIB型纤维（快型肌纤维）在肌肉中所占比例的增加有助于肉产量的增加[10]，而过快的生长速率则会直接影响肌肉的品质。可以合理的推断，Six1基因很可能会影响IIB型肌纤维形成，并与猪产肉性能及肌肉品质的有着密切的联系。 然而，目前对Six1基因的上游转录调控机制的研究相对较少。本研究以Six1基因启动子区不同SNP变异位点为研究对象，探索其对Six1基因启动子活性的影响，进而初步揭示Six1基因转录表达调控机制。本实验首先对Six1基因启动子序列中的遗传变异位点在不同猪种中进行了鉴定，并构建包含不同遗传变异位点的启动子片段的双荧光素酶报告载体，进一步在细胞水平对遗传变异位点对启动子活性的影响进行检测。本研究的开展可为猪Six1基因的转录表达调控机制提供新的理论依据。
1 材料与方法
1.1 主要仪器与设备
超净工作台、CO2细胞培养箱、台式冷冻离心机、超低温冰箱、微型紫外可见分光光度计、-20℃冰箱、普通PCR仪、电泳凝胶成像系统、微波炉、电泳仪、电泳槽、荧光显微镜、可调式微量移液器、千分之一电子天平、高压消毒锅、摇床、单管酶标仪
1.2 试验方法
1.2.1引物设计
从美国国家生物技术信息中心（NCBI，National Center for Biotechnology Information，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）下载猪Six1基因启动子序列，然后利用Premier Primer 5软件设计扩增Six1基因近端启动子引物，基因扩增的引物信息见表1
表1 Six1基因扩增引物序列与扩增条件
引物名称 Primer name 引物序列 Primer sequences (5’-3’) 退火温度Annealing Temperature (℃) 延伸时间time 长度 Size (bp)
SP3F SP3R TACCGAATCACAAATGAACCC TTTATGCAGGCGGAAAGACA 60℃ 60s 912
1.2.2 PCR扩增
以构建连有目的片段的T载体为模板，利 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
用SP3F与SP3R引物对扩增912bp片段（-736bp-+176bp）。扩增体系如下：
5×Transtart Buffer 10μL
2.5dNTP 5μL
上游引物P5-1F 2μL
下游引物P5-1R 2μL
Transtart DNA polymerase 1μL
蒸馏水 28μL
质粒 2μL
总体积50ul
以上成分于冰上添加，混匀后离心。
PCR反应条件：98℃预变性2min；98℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1min10 s，32 PCR循环；72℃延伸10min。
PCR扩增产物使用含DNA green 染料的1.5%琼脂糖凝胶在含TBE缓冲液电泳槽中进行电泳，电压120伏，电泳完成后紫外灯下拍照。
1.2.3 PCR产物纯化
（1）柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500 μl的平衡液BL，12,000 rpm(~13,400×g ) 离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2重新放回收集管中。
（2）估计PCR反应液或酶切反应液的体积，向其中加入5倍体积的结合液PB，充分混匀（无需去除石蜡油或矿物油）。注意：如PCR反应体系为50 μl（不包括石蜡油体积）， 则加入250 μl结合液PB。
（3）将上一步所得溶液加入一个吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中），室温放置2 min，12,000 rpm (~13,400×g )离心30-60 sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。
37℃酶切过夜，1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，并送测序。
1.2.8 转染
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