进口肉牛赤羽病的检测方法的优化及流行病学分析
：赤羽病是我国从澳大利亚进口活牛必检的七种疾病之一，目前常用的检疫方法是微量血清中和试验和阻断ELISA，本课题在实验室内建立了微量血清中和试验，对其中细胞悬液的制备做出了优化，并对常用的赤羽病检测方法做出了分析对比。通过优化后的微量血清中和试验对澳大利亚进口的4176头肉牛进行了检疫，发现有16个阳性个体，阳性率为3.83‰，并对实验室留存的来自江苏省5个养牛场的647份血清样本进行了检测，发现平均阳性率为22.46%（17.80%-33.83%），说明江苏省内养牛场存在赤羽病的流行，并有爆发的潜在风险。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2.1 细胞2
1.2.2 血清2
1.2.3 病毒2
1.2.4 试剂2
1.2.5 设备2
1.2 方法 2
1.2.1 细胞悬液浓度优化2
1.2.2 病毒毒价测定3
1.2.3 微量血清中和试验3
2 结果与分析3
2.1 细胞浓度优化3
2.2 病毒毒价5
2.3 微量血清中和试验结果5
2.3.1 进口肉牛赤羽病检疫结果5
2.3.2 江苏奶牛场赤羽病检疫结果5
3 讨论 6
3.1 赤羽病检测方法的优化6
3.2 进口肉牛赤羽病检疫的重要性7
3.3 警惕赤羽病在国内的流行7
致谢8
参考文献8
进口肉牛赤羽病的检测方法的优化及流行病学分析
引言
赤羽病是我国规定的A类疾病，是我国进口牛羊必检的七种疾病之一，也是我国进出境检疫工作的重要部分。我国至少有16个省市检出赤羽病血清型为阳性，上海地区曾在1997年爆发过赤羽病，说明赤羽病在我国流行较广。而赤羽病在成年动物上症状不明显，因此急需找到一种简便，准确，快速的方法，对赤羽病进行检疫，从而达到防控疾
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病的目的。
赤羽病（Akabane disease，AKAD）又称阿卡斑病，由布尼病毒科布尼病毒属辛波病毒群的赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）引起，常发于牛、绵羊和山羊等动物，是以流产、早产、死胎、木乃伊胎、胎儿畸形、新生胎儿发生关节弯曲和积水性无脑综合征为临床特征的多型性传染病。本病的传播媒介为蚊、库蠓等吸血昆虫，通过吸血昆虫叮咬而传播。具有明显的季节性和地区性，并常表现周期性。孕期的牛、绵羊、山 羊对AKAV最易感，发育后期胎儿常会感染[1]。上世纪30年代，该病在澳大利亚羊群中首次发病，而后1949年在日本也曾爆发，1961年在日本群马县赤羽村的畜舍内采集的金色库蚊和三带缘库蚊中首次分离出病毒，并将其命名为赤羽病病毒，此后在澳大利亚，肯尼亚，以色列等国家也相继分离到病毒[2]。农业部动物检疫所1990年首次证实了该病在我国的存在[3]，并于1998年完成了病毒的分离鉴定[4]。研究表明，该病在我国广泛存在，一旦暴发将会给我国畜牧业造成严重的经济损失[5]。赤羽病是目前对牛羊饲养产业危害较为严重的疫病，从澳大利亚等温热带国家进口牛羊时，常检测到赤羽病阳性个体，风险较高[6]。
赤羽病诊断技术经历了早期的病毒分离鉴定到血清学试验，再到更快速更特异的分子诊断方法，准确率和检测速度都有很大的提高。目前检疫行业内常用的方法是微量血清中和试验和阻断型ELISA，其中微量血清中和试验具有成本低，准确率高的优点。本课题的目的是在本实验室内建立和优化赤羽病微量血清中和试验的方法。微量血清中和试验需要将细胞悬液和病毒混合培养，观察病毒在细胞单层上形成的CPE（24天）及蚀斑现象（45天），因此细胞悬液的密度直接影响试验结果，如果细胞密度太大,细胞在培养板孔内不能充分长开，细胞单层上就会堆积一些未发芽的圆细胞或细胞团块，这样就影响CPE的观察。如果密度太小，细胞不易长成单层，这也影响结果的判定。因此本课题对细胞悬液的浓度进行优化，并通过优化后的微量血清中和试验完成进口肉牛赤羽病的检疫并对江苏省内奶牛场的赤羽病流行情况做一调查。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细胞 实验室保存的Vero细胞，购自南京金斯瑞生物科技有限公司。复苏冻存在液氮中的细胞，传代培养至细胞单层。
1．1．2 血清
1．1．2．1标准阳性血清：澳大利亚赠送羊高免血清,效价为1:128。
1．1．2．2标准阴性血清：不含AKV抗体的健康牛、羊血清。
1．1．2．3被检血清：使用无菌采血管采集血液，不加防腐剂，离心后在无菌条件下取血清。以上三种血清均于56℃灭活30分钟。澳大利亚进口肉牛血清采集于2016年10月初，江苏省各牛场血清采集于2016年11、12月。
1．1．3 病毒
AKV种毒(澳大利亚AKabane VB1335株)
1．1．4 试剂
1．1．4．1 细胞培养液：MEM培养基，加入10％无AKAV抗体的胎牛血清（56℃，30min灭活），抽滤除菌，分装，置4℃保存备用，有效期1个月。用于制备组织悬液时，使用前加入双抗，使其终浓度为含青霉素2000IU/mL，链霉素2000μg/mL。用于细胞培养时，使用前加入双抗，使其终浓度为含青霉素200IU/mL，链霉素200μg/mL。
1．1．4．2 细胞维持液：MEM培养基，加入2％无AKAV抗体的胎牛血清（56℃，30min灭活），抽滤除菌，分装，置4℃保存备用，有效期1个月。使用前加入双抗，使其终浓度为含青霉素200IU/mL，链霉素200μg/mL。
1．1．4．3 细胞分散液：胰酶2.50g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.20g，0.01mol/L，pH7.4的PBS1000mL抽滤除菌，分装。置20℃ 保存备用。
1．1．5 设备
高速离心机，Thermo公司。水浴锅,herrytech公司 HHUS型。超净工作台及生物安全柜，?LABCONCO公司。倒置显微镜，Nikon公司。
1．2 方法
1．2．1 细胞悬液浓度优化
从液氮容器中取出冷存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动；令其尽快融化，加到离心管中并滴加10倍以上培养液，混匀，离心，1000rpm，5min,弃去上清液，加入含有10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种于培养瓶中，37℃培养箱静置培养，次日更换一次培养液，将复苏的细胞培养至细胞单层。
用胰酶消化培养至细胞单层的Vero细胞，加入细胞培养液，浓度分别调整至1×106个/ml，2×106个/ml，3×106个/ml，4×106个/m，5×106个/ml，6×106个/ml，选用九十六孔细胞板进行实验，每孔加入100ul细胞悬液和100ul细胞培养液，每个浓度设置5孔平行对照，逐日观察，并在72h及120h时记录细胞生长状态，选择细胞生长最优（不出现细胞堆积且细胞单层覆盖率高）的浓度值。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.2.1 细胞2
1.2.2 血清2
1.2.3 病毒2
1.2.4 试剂2
1.2.5 设备2
1.2 方法 2
1.2.1 细胞悬液浓度优化2
1.2.2 病毒毒价测定3
1.2.3 微量血清中和试验3
2 结果与分析3
2.1 细胞浓度优化3
2.2 病毒毒价5
2.3 微量血清中和试验结果5
2.3.1 进口肉牛赤羽病检疫结果5
2.3.2 江苏奶牛场赤羽病检疫结果5
3 讨论 6
3.1 赤羽病检测方法的优化6
3.2 进口肉牛赤羽病检疫的重要性7
3.3 警惕赤羽病在国内的流行7
致谢8
参考文献8
进口肉牛赤羽病的检测方法的优化及流行病学分析
引言
赤羽病是我国规定的A类疾病，是我国进口牛羊必检的七种疾病之一，也是我国进出境检疫工作的重要部分。我国至少有16个省市检出赤羽病血清型为阳性，上海地区曾在1997年爆发过赤羽病，说明赤羽病在我国流行较广。而赤羽病在成年动物上症状不明显，因此急需找到一种简便，准确，快速的方法，对赤羽病进行检疫，从而达到防控疾
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病的目的。
赤羽病（Akabane disease，AKAD）又称阿卡斑病，由布尼病毒科布尼病毒属辛波病毒群的赤羽病病毒（Akabane virus，AKAV）引起，常发于牛、绵羊和山羊等动物，是以流产、早产、死胎、木乃伊胎、胎儿畸形、新生胎儿发生关节弯曲和积水性无脑综合征为临床特征的多型性传染病。本病的传播媒介为蚊、库蠓等吸血昆虫，通过吸血昆虫叮咬而传播。具有明显的季节性和地区性，并常表现周期性。孕期的牛、绵羊、山 羊对AKAV最易感，发育后期胎儿常会感染[1]。上世纪30年代，该病在澳大利亚羊群中首次发病，而后1949年在日本也曾爆发，1961年在日本群马县赤羽村的畜舍内采集的金色库蚊和三带缘库蚊中首次分离出病毒，并将其命名为赤羽病病毒，此后在澳大利亚，肯尼亚，以色列等国家也相继分离到病毒[2]。农业部动物检疫所1990年首次证实了该病在我国的存在[3]，并于1998年完成了病毒的分离鉴定[4]。研究表明，该病在我国广泛存在，一旦暴发将会给我国畜牧业造成严重的经济损失[5]。赤羽病是目前对牛羊饲养产业危害较为严重的疫病，从澳大利亚等温热带国家进口牛羊时，常检测到赤羽病阳性个体，风险较高[6]。
赤羽病诊断技术经历了早期的病毒分离鉴定到血清学试验，再到更快速更特异的分子诊断方法，准确率和检测速度都有很大的提高。目前检疫行业内常用的方法是微量血清中和试验和阻断型ELISA，其中微量血清中和试验具有成本低，准确率高的优点。本课题的目的是在本实验室内建立和优化赤羽病微量血清中和试验的方法。微量血清中和试验需要将细胞悬液和病毒混合培养，观察病毒在细胞单层上形成的CPE（24天）及蚀斑现象（45天），因此细胞悬液的密度直接影响试验结果，如果细胞密度太大,细胞在培养板孔内不能充分长开，细胞单层上就会堆积一些未发芽的圆细胞或细胞团块，这样就影响CPE的观察。如果密度太小，细胞不易长成单层，这也影响结果的判定。因此本课题对细胞悬液的浓度进行优化，并通过优化后的微量血清中和试验完成进口肉牛赤羽病的检疫并对江苏省内奶牛场的赤羽病流行情况做一调查。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 细胞 实验室保存的Vero细胞，购自南京金斯瑞生物科技有限公司。复苏冻存在液氮中的细胞，传代培养至细胞单层。
1．1．2 血清
1．1．2．1标准阳性血清：澳大利亚赠送羊高免血清,效价为1:128。
1．1．2．2标准阴性血清：不含AKV抗体的健康牛、羊血清。
1．1．2．3被检血清：使用无菌采血管采集血液，不加防腐剂，离心后在无菌条件下取血清。以上三种血清均于56℃灭活30分钟。澳大利亚进口肉牛血清采集于2016年10月初，江苏省各牛场血清采集于2016年11、12月。
1．1．3 病毒
AKV种毒(澳大利亚AKabane VB1335株)
1．1．4 试剂
1．1．4．1 细胞培养液：MEM培养基，加入10％无AKAV抗体的胎牛血清（56℃，30min灭活），抽滤除菌，分装，置4℃保存备用，有效期1个月。用于制备组织悬液时，使用前加入双抗，使其终浓度为含青霉素2000IU/mL，链霉素2000μg/mL。用于细胞培养时，使用前加入双抗，使其终浓度为含青霉素200IU/mL，链霉素200μg/mL。
1．1．4．2 细胞维持液：MEM培养基，加入2％无AKAV抗体的胎牛血清（56℃，30min灭活），抽滤除菌，分装，置4℃保存备用，有效期1个月。使用前加入双抗，使其终浓度为含青霉素200IU/mL，链霉素200μg/mL。
1．1．4．3 细胞分散液：胰酶2.50g，乙二胺四乙酸二钠（EDTA）0.20g，0.01mol/L，pH7.4的PBS1000mL抽滤除菌，分装。置20℃ 保存备用。
1．1．5 设备
高速离心机，Thermo公司。水浴锅,herrytech公司 HHUS型。超净工作台及生物安全柜，?LABCONCO公司。倒置显微镜，Nikon公司。
1．2 方法
1．2．1 细胞悬液浓度优化
从液氮容器中取出冷存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动；令其尽快融化，加到离心管中并滴加10倍以上培养液，混匀，离心，1000rpm，5min,弃去上清液，加入含有10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种于培养瓶中，37℃培养箱静置培养，次日更换一次培养液，将复苏的细胞培养至细胞单层。
用胰酶消化培养至细胞单层的Vero细胞，加入细胞培养液，浓度分别调整至1×106个/ml，2×106个/ml，3×106个/ml，4×106个/m，5×106个/ml，6×106个/ml，选用九十六孔细胞板进行实验，每孔加入100ul细胞悬液和100ul细胞培养液，每个浓度设置5孔平行对照，逐日观察，并在72h及120h时记录细胞生长状态，选择细胞生长最优（不出现细胞堆积且细胞单层覆盖率高）的浓度值。
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