猪繁殖与呼吸综合征的检测
间接ELISA具有良好的特异性和较高的敏感性，并且操作过程简易，已经广泛应用于猪繁殖与呼吸综合征的检测。荧光RT-PCR技术是近年来发展起来的一项新技术，已广泛应用于很多病原体的检测。采用猪繁殖与呼吸综合征病毒抗原间接ELISA检测试剂盒对江苏B猪场送检的进口种公猪血样进行检测，从而帮助该猪场避免在引种过程中引进该病。采用实时荧光定量RT-PCR技术对江苏B猪场和浙江Z猪场两个猪场送检六批发病猪血样进行检测，确定其是否感染猪繁殖和呼吸综合征病毒（PRRSV），协助猪场对该病进行诊断，检测结果快速准确，便于猪场确定病原从而更有效的治疗。关键字猪繁殖与呼吸综合征；间接ELISA；荧光RT-PCR；检测 Detection?of porcine reproductive and respiratory syndromeStudent majoring in veterinary medicine Chen Qian Tutor Lei ZhihaiAbstractIndirect ELISA with good specificity，high sensitivity, and easy operation has been widely used in porcine reproductive and respiratory syndrome detection. Real-time PCR is a new technology developed in recent years and has been widely used in the detection of many pathogens. We detected the blood samples from imported boars dilevering by the B pig farm in Jiangsu province with porcine reproductive and respiratory syndrome virus indirect ELISA in order to void bring in the disease during importing. Six batch of blood samples from the B pig farms in Ji *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
angsu and the Z pig farms in Zhejiang were detected by Real-time RT-PCR in order to confirm if they infected the PRRSV, which will help pig farms to dignos and control the disease.猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrom，PRRS），又称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的，以怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎、早产、产弱仔等繁殖障碍和仔猪呼吸困难、高死亡率及育肥猪呼吸道症状为特征的一种病毒病。1987年美国明尼苏达州首次报道本病[1]，随后很快扩展到北美和欧洲一些国家。荷兰中央兽医研究所Wensvoort[2]等研究人员于1991年首次分离出了本病病毒，并暂时定名为Lelystad病毒（LV）。我国于1996年由郭宝清等[3]首次报道，从国内疑似发病猪群中检出PRRS抗体，并分离到PRRSV，证实了我国大陆存在PRRS疾病的流行。国内外血清学实验和基因序列分析表明，PRRSV可划分为两种基因型毒株，即美洲型毒株（代表毒株为ATCC VR-2332）和欧洲型毒株（代表毒株为LV）。 该病近几年给我国养猪业带来了巨大的经济损失。防控该病重在预防和监测。因此，本文开展了两方面的工作，一是采用间接ELISA方法对江苏B猪场引进的进口种公猪血样进行检测，避免在引种过程中将PRRS病毒带进猪场，从源头上控制该病，起到净化猪场的作用。二是采用实时荧光定量RT-PCR对江苏B猪场和浙江Z猪场2个猪场6批发病猪的送检血样进行检测，以判断是否被PRRSV感染，协助猪场确诊该病，对猪场后期治疗以及预防具有重要意义。1 材料与方法 1.1材料与主要试剂IDEXX公司生产的PRRSV检测试剂盒；本实验室分离的PRRSV S1株（美洲株）和高致病性PRRSV毒株SY0608、Ambion公司生产的AgPath-ID One-step RT-PCR试剂盒、TRIZOL试剂；TaKaRa公司生产的AMV反转录酶、Ex TaqTM酶、pMD18-T Vector试剂盒、胶回收试剂盒等试剂。1.2 样品采集江苏B猪场引进的进口种公猪血样92份。江苏B猪场、浙江Z猪场2个猪场6批发病猪送检血样212份。1.3间接EILSA 用IDEXX公司生产的Elisa试剂盒对送检样品按说明书进行检测，具体步骤如下 (1) 将血样倒入EP管中离心3 min后倒入新的EP关键中得到血清 (2) 将分离好的血清用样品稀释液40倍稀释样品 (3) 取出抗原包被板，在记录表上记录样本的位置。 (4) 在包被孔内加入100 μL 没有稀释的阴性对照，每次检测加两孔。 (5) 在包被孔内加入100 μL 没有稀释的阳性对照，每次检测加两孔。 (6) 在相应的孔中加入100 μL 已稀释好的样本。 (7) 18～25 ℃孵育30±2 分钟。 (8) 吸取各孔的液体弃入废液筒。 (9) 用大约300 μL 洗涤液洗涤板孔，共洗涤3-5 次。每次洗涤后应吸去孔内的液体。 (10) 每孔加入100 μL 辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG 抗体。 (11) 18-25 ℃孵育30±2 分钟。 (12) 重复步骤6 和7。 (13) 每孔加入100 μL TMB 底物液。 (14) 18-25 ℃孵育15±1 分钟。 (15)每孔加入100 μL 终止液，终止反应。 (16)测量并且记录样本和对照的吸光值A(650)。 (17)计算结果。 阴性对照平均值的计算（NCx） NCx=NC1 A650+ NC2 A650 例如 阳性对照平均值的计算（PCx） PCx=PC1 A650+ PC2 样本/阳性对照比率的计算（S/P） : S/P=(样本A(650)－NCx)／(PCx－NCx) 结果阐述 PRRS 抗体的有无（阳性/阴性）通过计算每个样品的S/P 值判定。 如果S/P 值低于0.4，样品应判定为PRRS 抗体阴性。 如果S/P 值大于或等于0.4，样品应判定为PRRS 抗体阳性。1.4荧光实时定量RT-PCR1.4.1引物与探针设计本文所用U1和U6两套引物和荧光探针（图1）由江苏出入境检验检疫局动植食检测中心动物实验室设计，引物与探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。图1荧光RT-PCR引物/探针 Fig. 1 The Primers/probes of Real-time RT-PCR1.4.2 RNA提取和cDNA的合成 将血样倒入EP管中，离心3 min后将上清倒入EP’管中。取EP管中的沉淀 200 μL，加入TRIZOL试剂600 μL，混匀，室温静置2～3 min，加入氯仿200 μL，混匀，4 ℃ 12000 rpm离心15 min，取上清加入0.8体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，4 ℃ 12000 rpm离心10 min，小心倾去上清，75%的乙醇洗涤沉淀，室温干燥3～5 min，DEPC水10 μL溶解沉淀。 取PCR管依次加入5×AMV Buffer 4 μL、dNTP(各10 mM) 2 μL、RNase Inhibitor 20 U、Oligo(dT)或下游引物50 pmol、AMV反转录酶10 U、RNA模板2～5 μL、DEPC水至20 μL。瞬间离心，45 ℃反转录1 h后，迅速冷却至4 ℃，分装，立即用于PCR或于-80 ℃保存备用。1.4.3 荧光实时定量RT-PCR采用25 μL反应体系，取Lightcycler毛细管依次加入10×Ex Taq Buffer 2.5 μL、dNTP(2.5mM) 3 μL、MgCl2（25 mM） 5.5 μL、引物（20 μM）各0.5 μL、TaqMan探针（10μM）1 μL、Ex TaqTM酶0.25 μL、BSA（0.05%） 4 μL、cDNA 1 μL、dH2O至25 μL。瞬间离心后于Lightcycler定量PCR仪进行PCR扩增。扩增条件95℃预变性5 min后；95 ℃ 20 s、60 ℃ 1 min，45个循环。检测结束，根据噪声情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果。每次检测时，同时设置阴性对照和阳性对照。2 结果2.1间接ELISA实验结果本文对江苏B猪场送检的92份进口种公猪样品进行了检测，各样品650 nm下的吸光值见表1，S/P值见表2，92份样品的 S/P值均小于0.4，判定为PRRSV阴性。结果表明，该批进口种公猪没有感染PRRSV。表1 种公猪血样650 nm下的吸光值Table 1 OD 650 of boars blood samples1234567891011120.0670.0910.1010.0780.0660.0740.1090.1170.0830.0890.1080.086A0.1360.0970.0750.0810.1260.0780.0820.0720.1230.0810.2410.083B0.0840.0840.0970.0730.1110.2540.0890.0820.1060.0790.0750.083C0.0740.0710.0690.0410.1480.0930.0780.0890.040.0820.0610.105D0.260.0650.0570.0640.0910.0630.0860.0670.0680.0390.0440.061E0.0940.0620.1310.0940.070.090.0840.0740.1130.2030.2730.057F0.1090.0890.1690.0690.0410.1250.0870.0870.0730.0680.0840.721G0.0810.0620.0770.0980.0730.0860.0850.210.070.1440.0690.758H表2 种公猪血样的 S/P值Table 2 S/P values of boars blood samples1234567891011120.01 0.05 0.06 0.03 0.01 0.02 0.07 0.09 0.04 0.04 0.07 0.04 A0.11 0.06 0.02 0.03 0.10 0.03 0.03 0.02 0.09 0.03 0.27 0.04 B0.04 0.04 0.06 0.02 0.08 0.29 0.04 0.03 0.07 0.03 0.02 0.04 C0.02 0.02 0.01 -0.03 0.13 0.05 0.03 0.04 -0.03 0.03 0.00 0.07 D0.30 0.01 0.00 0.01 0.05 0.01 0.04 0.01 0.01 -0.03 -0.02 0.00 E0.05 0.00 0.11 0.05 0.02 0.05 0.04 0.02 0.08 0.21 0.31 0.00 F0.07 0.04 0.16 0.01 -0.03 0.10 0.04 0.04 0.02 0.01 0.04 0.97 G0.03 0.00 0.03 0.06 0.02 0.04 0.04 0.22 0.02 0.12 0.01 1.03 H2.2荧光RT-PCR结果本文采用荧光实时定量RT-PCR方法对江苏B猪场和浙江Z猪场2个猪场的6批212份样品进行了检测，结果见图2～7，共检出PRRSV阳性样品9份（a、c、e、f、g、i、k、l、m），占所检样品的4.2%；其中江苏B猪场3批样品PRRSV阳性率为分别为10%、11.8%和2.2%（图2～4，表3），浙江Z猪场3批送检血样只有第一批PRRSV阳性率为10%，其余2批均为PRRSV阴性（图5～7，表4）。结果表明，江苏B猪场有感染PRRSV的情况，但在可控制范围内，经过一段时间的治疗有所好转。浙江Z猪场同样存在PRRSV感染的情况，经过一段时间的净化，可判定PRRSV为阴性。图2 江苏B猪场第一批血样RT-PCR检测结果Fig. 2 Results of first batch of blood samples from the B pig farm in Jiangsu detected by RT-PCR图3 江苏B猪场第二批血样RT-PCR检测结果Fig. 3 Results of second batch of blood samples from the B pig farm in Jiangsu detected by RT-PCR图4 江苏B猪场第三批血样RT-PCR检测结果Fig. 4 Results of third batch of blood samples from the B pig farm in Jiangsu detected by RT-PCR图5 浙江Z猪场第一批血样RT-PCR检测结果Fig. 5 Results of first batch of blood samples from the Z pig farm in Zhejiang detected by RT-PCR图6 浙江Z猪场第二批血样RT-PCR检测结果Fig. 6 Results of second batch of blood samples from the Z pig farm in Zhejiang detected by RT-PCR图7 浙江Z猪场第三批血样RT-PCR检测结果Fig. 7 Results of third batch of blood samples from the Z pig farm in Zhejiang detected by RT-PCR表3 江苏B猪场3批血样PRRSV RT-PCR检测结果Table 3 Results of three batch of blood samples from the B pig farm in Jiangsu for PRRSV detected by RT-PCR表4 浙江Z猪场3批血样PRRSV RT-PCR检测结果Table 4 Results of three batch of blood samples from the Z pig farm in Zhejiang for PRRSV detected by RT-PCR3 讨论 3.1 猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统的传染病。该病在世界范围内广泛流行，给世界养猪业带来了巨大的经济损失。早在20世纪80年代初至90年代初，在北美和欧洲流行以猪繁殖障碍和呼吸道疾病为主要特征的新型疾病，经初步研究确定为动脉炎病毒感染所致，以其临床特征命名为猪繁殖和呼吸综合征病毒[1]。美国于1987年爆发该病，1997年出现超强毒力型变异株，接种过猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的猪同样发病，母猪流产率10％~20％，病死率20％，有中枢神经症状。被称为母猪流产和死亡综合征。2006年我国首次爆发由该病毒的变异株引起的“猪无名高热症”，也称蓝耳病，给我国养猪业带来了巨大的经济损失[2]。我国农业部将高致病性猪繁殖与呼吸综合征列为一类动物传染病进行防治。2007年北美爆发的猪繁殖与呼吸综合征比中国2006~2007年发生的高致病性猪繁殖与呼吸综合征还要严重，超过20％的母猪死亡，多达50％的母猪流产。猪繁殖与呼吸综合征病毒属尼多病毒目，动脉炎病毒科、动脉炎病毒属[3]，与其同属的有鼠乳酸脱氢酶病毒（LDV）、猴出血热病毒（SHFV）、马动脉炎病毒（EAV）。国内外血清学实验和基因序列分析表明，PRRSV可划分为两种基因型，即美洲型（代表毒株为ATCC VR-2332）和欧洲型（代表毒株为LV），两者核苷酸序列同源性约60％。PRRSV为不分节段，聚腺苷酸化，有囊膜的单股正链RNA病毒。病毒粒子呈球形，病毒纯化后负染电镜观察，形态清晰，直径50～65nm。核衣壳直径30～35nm，核衣壳呈二十面体对称，囊膜表面有明显的纤突[4,5]。PRRSV对有机溶剂敏感，乙醚、氯仿等有机溶剂均可灭活病毒，脱氧胆酸钠和Triton-X-100可使PRRSV失去感染力。该病毒主要有两个亚型，即美洲型和欧洲型[6]。美洲型具有更强的致病力[7]。PRRSV可以在PAM、MARC-145、CL-2621等细胞上复制，然而不是每种细胞系都适合PRRSV的生长的，这也就是说如果可能的话需要用至少二种细胞系来进行病毒的分离培养。但分离欧洲株PRRSV只能用PAM细胞[8]。PRRSV可以在多种临床样品中分离得到，其中包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺、淋巴结、脾、胸腺、心、脑、肝、睾丸、输精管等，其中血清和肺灌洗液最适合病毒分离。PRRSV在血清中存在比组织中稳定，而老龄动物由于病毒血症的时间短，则病毒在组织中存在的时间长。组织必须及时送检才能保证病毒分离的成功。样品的选择同时也要根据感染的阶段(急性感染期、康复期、持续感染期)，在急性感染期，选择血清、肺、肺灌洗液作为样品比较好，而持续感染的动物则选择口、鼻棉拭以及肺灌洗液较好[9]。 2006年以来，虽然高致病性蓝耳病在我国大流行，国内目前所报道的分离株仅为美洲株，尚未见欧洲株的报道，但随着频繁的进出口贸易，欧洲株很可能会传入我国，必须提高警惕，防止该病毒从国外传入。因此，必须通过间接ELISA、RT-PCR等技术加强进出口检验检疫[10]。此外，由于猪繁殖与呼吸综合征缺乏特征性的发病症状，易于其他病原混合感染，给临床诊断增大了难度[11]。在养殖过程中，耐过猪可长期带毒并不断向外界排毒，造成的持续性感染不利于猪场的健康发展[12]。因此，需要实验室检测特定病原以助确诊，同时在猪场引进种猪时也应严格把关，起到净化猪场的效果[13]。3.2 PRRSV检测方法目前检测PRRSV的常用方法有ELISA、病毒分离、RT-PCR等。病毒分离操作烦琐，成本较高，周期较长，并且对病料的要求较高。间接ELISA是检测PRRSV感染的常规方法，该方法敏感性高，检测快速，利用猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒配合先进的光谱扫描多功能读数仪，可以非常高效的完成整个检测，送检样品24 h内可以得出检测报告。Albina等(1992)[14]开发的用于检测生长在PAM细胞上的抗原的ELISA得到了广泛应用，其方法是将PRRSV接种PAM上培养，制备阳性抗原，并用相同的方法制备模拟抗原。当阳性抗原孔的OD值与模拟抗原孔的OD值之比大于1.5时判断样品为阳性。对试验感染猪血清和从未暴发本病地区采集的猪血清进行抗体检查，证实ELISA的敏感性、特异性和符合率均比IPMA高，而且早期抗体的检测比用IPMA更为敏感，法国已将ELISA作为监测和诊断本病的常见方法。常用的有Dot-ELISA、阻断ELISA，因其敏感性高、经济、快速，适用于短期内大批量血清样品的检测。最近，ELISA又有新报道，许立华等[15]利用PRRSV核衣壳蛋白基因的原核表达产物，分别建立了检测PRRS抗体的间接ELISA方法及乳胶凝集试验，与美国IDEXX公司研制的ELISA试剂盒相比，检出符合率分别为78%和91%。此法避免了以活病毒作为抗原检测时造成的散毒现象。夏向荣等[16]以PRRSV核衣壳蛋白(N蛋白)基因的原核表达产物重组N蛋白为包被抗原，利用兔抗重组N蛋白血清和PRRS猪血清竞争该抗原，建立间接竞争ELISA方法检测PRRS抗体。该方法特异性强，稳定性和重复性好，整个检测过程可在3h内完成。以IDEXX试剂盒的检测结果为参照标准，该方法的敏感性为79.76%，特异性为90.9%，符合率为83.59%。将该方法按试剂盒要求标准化，4℃放置5个月，检测效果不变。江云波等[17]，利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统将PRRSV的ORF5和ORF6基因依序串联于GST下游，并在大肠杆菌中成功表达，获得了大小约为相对分子质量60000的融合蛋白，以纯化的融合蛋白为抗原建立了PRRS P56-ELISA检测方法，与国外试剂盒IDEXX-ELISA总符合率为94.1%，表明建立的P56-ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。陈义平等[18]用亲和层析纯化的PRRSV重组核衣壳蛋白GST-N作为诊断抗原，建立PRRS检测血清抗体的间接ELISA方法。与HerdChek ELISA相比，间接ELISA的敏感性为94.5%，特异性为91.3%，总符合率为92.9%，Youden指数为0.86。同时还证明该方法具有良好的批间和批内重复性，并且不与猪瘟、猪伪狂犬病等阳性血清发生反应。顾小雪等[19]利用GST-GP5AB重组蛋白作为包被抗原，通过反应条件优化，建立了用于检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。该抗原与猪其他4种临床症状类似的疾病的阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果，变异系数均小于7%，表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法初步检测了一些疫苗免疫仔猪血清样品，并与重组N蛋白和PRRSV抗原同时进行比较，结果显示3种抗原检测的结果基本一致。 经免疫过的猪群可能在一段时间内使用间接ELISA的样品可能出现假阳性的情况，可以将检测为阳性的样品再次进行RT-PCR检测以确实。其原理是将重组的PRRSV 抗原包被在微孔滴定板上，被测样品在包被孔中孵育时，针对PRRSV的特异性抗体与包被的抗原形成抗原抗体复合物，洗去包被孔中没有结合的成分后，加入辣根过氧化物酶（HRPO）标记的抗猪抗体，它与孔中的猪抗体结合，在试验的最后步骤，洗去没有结合的酶标抗体，再加入酶底物和显色剂TMB，颜色反应的深浅由样品中存在的抗PRRSV 特异性抗体的量决定。 RT-PCR简单、方便、快速，敏感，但仍然存在假阳性和PCR污染等弊端。荧光RT-PCR技术是近年来发展起来的一项快速、特异、灵敏且无EB污染的新型检测技术，其扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果。该技术从根本上解决了PCR扩增产物污染的问题，但也容易受到很多因素的干扰。现在春季传染病多发期，猪场送检样品多数为混合感染，存在同时检测多种疾病的状况，可以根据需要做多重RT-PCR进行检测确诊。送检样品数目庞大，全部进行RT-PCR时工作量过大，无法及时得出结论时，可以采取混样的方法，根据总量和养殖情况采取按圈舍为单位进行样品混样进行快速排查。 实时荧光PCR作为一项比较新颖的技术已被广泛应用于病毒性疾病的研究和临床诊断上。目前，根据采用荧光素发光原理不同，实时荧光PCR可分为SYBR染料、TaqMan、Lightcycler、Lux primer、分子信标等技术[20]。其中以TaqMan技术使用最为普遍，其特异性和敏感性方面也很高，而且原理简单。即PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移，FRET)，因此探针完整时，检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光[21]。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5’-3’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此探针对于扩增片段上的碱基突变很敏感，如果在探针结合区域有一个碱基突变，就会使特异性和敏感性发生严重的降低（通常可降低数百倍甚至上千倍），严重时可直接影响检测结果的真实性，造成假阴性的结果[22]。在Real-time PCR反应过程中，首先需设定一个荧光信号的域值(threshold)，一般以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)。荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到的荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。在Real-time PCR中，模板定量有两种策略相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。本研究中，我们采用绝对定量的方法，将质粒和病毒滴度作为绝对定量标准品，根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。综上所述，本文所采用的检测PRRSV的间接ELISA和荧光RT-PCR方法敏感性高，特异性强，操作方便快速，而且不容易造成分子生物学方面的污染，是PRRSV诊断和监测及肉品安全检测的有效手段。3.3 检测结果分析猪繁殖与呼吸综合征是危害我国养猪业的重大传染病，为了防控该病，一是要防止从国外引入该病，二是要加强本病的检测，净化猪场。因此，江苏B猪场将引进的92头种公猪血样送检，经过本实验用ELISA检测均为阴性，说明引进的种公猪未感染PRRSV，在引种过程中杜绝了该病的流入。此外，江苏B猪场和浙江Z猪场将发病猪血样分三批送检，经过本实验用荧光RT-PCR方法检测，部分样品PRRSV阳性，表明该猪场不同程度感染了PRRSV，病原得到确诊。经过确诊后，该猪场进行针对该病的治疗，取得了较好的效果。通过间接ELISA和荧光RT-PCR的检测，快速有效的检测出PRRSV，指导猪场在引种时把关，在养殖中监测，对发病猪及时做出正确的反应，可起到缩短病程，淘汰带毒种猪的作用。长此以往，猪场可以在养殖过程中一步步的得到净化，减少不必要的经济损失。致谢参考文献[1]黎先伟, Nauwynck H. 猪蓝耳病(PRRS)—过去、现在和未来. 兽医导刊[J]. 2015, (01):56-57.[2]谭诗文. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的研究进展. 贵州农业科学[J]. 2009(06):149-154.[3] Helmi Mardassiardassi. 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目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2引言 3
1 材料与方法4
1.1 材料与主要试剂 4
1.2样品采集 4
1.3 间接ELISA5
1.4 荧光RTPCR5
1.4.1引物与探针设计5
1.4.2 RNA的提取和cDNA的合成6
1.4.3荧光RTPCR6
2 结果6
2.1间接ELISA结果6
2.2荧光RTPCR结果7
3 讨论 11
3.1猪繁殖与呼吸综合征11
3.2 PRRSV检测方法12
3.3检测结果分析14
致谢14
参考文献14
附录 安佑云疾病自助诊断系统使用情况调查表9
猪繁殖与呼吸综合征的检测
引言
angsu and the Z pig farms in Zhejiang were detected by Real-time RT-PCR in order to confirm if they infected the PRRSV, which will help pig farms to dignos and control the disease.猪繁殖与呼吸综合征（Porcine Reproductiveand Respiratory Syndrom，PRRS），又称“蓝耳病”，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的，以怀孕母猪流产、死胎、木乃伊胎、早产、产弱仔等繁殖障碍和仔猪呼吸困难、高死亡率及育肥猪呼吸道症状为特征的一种病毒病。1987年美国明尼苏达州首次报道本病[1]，随后很快扩展到北美和欧洲一些国家。荷兰中央兽医研究所Wensvoort[2]等研究人员于1991年首次分离出了本病病毒，并暂时定名为Lelystad病毒（LV）。我国于1996年由郭宝清等[3]首次报道，从国内疑似发病猪群中检出PRRS抗体，并分离到PRRSV，证实了我国大陆存在PRRS疾病的流行。国内外血清学实验和基因序列分析表明，PRRSV可划分为两种基因型毒株，即美洲型毒株（代表毒株为ATCC VR-2332）和欧洲型毒株（代表毒株为LV）。 该病近几年给我国养猪业带来了巨大的经济损失。防控该病重在预防和监测。因此，本文开展了两方面的工作，一是采用间接ELISA方法对江苏B猪场引进的进口种公猪血样进行检测，避免在引种过程中将PRRS病毒带进猪场，从源头上控制该病，起到净化猪场的作用。二是采用实时荧光定量RT-PCR对江苏B猪场和浙江Z猪场2个猪场6批发病猪的送检血样进行检测，以判断是否被PRRSV感染，协助猪场确诊该病，对猪场后期治疗以及预防具有重要意义。1 材料与方法 1.1材料与主要试剂IDEXX公司生产的PRRSV检测试剂盒；本实验室分离的PRRSV S1株（美洲株）和高致病性PRRSV毒株SY0608、Ambion公司生产的AgPath-ID One-step RT-PCR试剂盒、TRIZOL试剂；TaKaRa公司生产的AMV反转录酶、Ex TaqTM酶、pMD18-T Vector试剂盒、胶回收试剂盒等试剂。1.2 样品采集江苏B猪场引进的进口种公猪血样92份。江苏B猪场、浙江Z猪场2个猪场6批发病猪送检血样212份。1.3间接EILSA 用IDEXX公司生产的Elisa试剂盒对送检样品按说明书进行检测，具体步骤如下 (1) 将血样倒入EP管中离心3 min后倒入新的EP关键中得到血清 (2) 将分离好的血清用样品稀释液40倍稀释样品 (3) 取出抗原包被板，在记录表上记录样本的位置。 (4) 在包被孔内加入100 μL 没有稀释的阴性对照，每次检测加两孔。 (5) 在包被孔内加入100 μL 没有稀释的阳性对照，每次检测加两孔。 (6) 在相应的孔中加入100 μL 已稀释好的样本。 (7) 18～25 ℃孵育30±2 分钟。 (8) 吸取各孔的液体弃入废液筒。 (9) 用大约300 μL 洗涤液洗涤板孔，共洗涤3-5 次。每次洗涤后应吸去孔内的液体。 (10) 每孔加入100 μL 辣根过氧化物酶标记的抗猪IgG 抗体。 (11) 18-25 ℃孵育30±2 分钟。 (12) 重复步骤6 和7。 (13) 每孔加入100 μL TMB 底物液。 (14) 18-25 ℃孵育15±1 分钟。 (15)每孔加入100 μL 终止液，终止反应。 (16)测量并且记录样本和对照的吸光值A(650)。 (17)计算结果。 阴性对照平均值的计算（NCx） NCx=NC1 A650+ NC2 A650 例如 阳性对照平均值的计算（PCx） PCx=PC1 A650+ PC2 样本/阳性对照比率的计算（S/P） : S/P=(样本A(650)－NCx)／(PCx－NCx) 结果阐述 PRRS 抗体的有无（阳性/阴性）通过计算每个样品的S/P 值判定。 如果S/P 值低于0.4，样品应判定为PRRS 抗体阴性。 如果S/P 值大于或等于0.4，样品应判定为PRRS 抗体阳性。1.4荧光实时定量RT-PCR1.4.1引物与探针设计本文所用U1和U6两套引物和荧光探针（图1）由江苏出入境检验检疫局动植食检测中心动物实验室设计，引物与探针均由宝生物工程（大连）有限公司合成。图1荧光RT-PCR引物/探针 Fig. 1 The Primers/probes of Real-time RT-PCR1.4.2 RNA提取和cDNA的合成 将血样倒入EP管中，离心3 min后将上清倒入EP’管中。取EP管中的沉淀 200 μL，加入TRIZOL试剂600 μL，混匀，室温静置2～3 min，加入氯仿200 μL，混匀，4 ℃ 12000 rpm离心15 min，取上清加入0.8体积的-20℃预冷的异丙醇，混匀，4 ℃ 12000 rpm离心10 min，小心倾去上清，75%的乙醇洗涤沉淀，室温干燥3～5 min，DEPC水10 μL溶解沉淀。 取PCR管依次加入5×AMV Buffer 4 μL、dNTP(各10 mM) 2 μL、RNase Inhibitor 20 U、Oligo(dT)或下游引物50 pmol、AMV反转录酶10 U、RNA模板2～5 μL、DEPC水至20 μL。瞬间离心，45 ℃反转录1 h后，迅速冷却至4 ℃，分装，立即用于PCR或于-80 ℃保存备用。1.4.3 荧光实时定量RT-PCR采用25 μL反应体系，取Lightcycler毛细管依次加入10×Ex Taq Buffer 2.5 μL、dNTP(2.5mM) 3 μL、MgCl2（25 mM） 5.5 μL、引物（20 μM）各0.5 μL、TaqMan探针（10μM）1 μL、Ex TaqTM酶0.25 μL、BSA（0.05%） 4 μL、cDNA 1 μL、dH2O至25 μL。瞬间离心后于Lightcycler定量PCR仪进行PCR扩增。扩增条件95℃预变性5 min后；95 ℃ 20 s、60 ℃ 1 min，45个循环。检测结束，根据噪声情况设定和调整基线和阈值，通过收集的荧光曲线和Ct值判定结果。每次检测时，同时设置阴性对照和阳性对照。2 结果2.1间接ELISA实验结果本文对江苏B猪场送检的92份进口种公猪样品进行了检测，各样品650 nm下的吸光值见表1，S/P值见表2，92份样品的 S/P值均小于0.4，判定为PRRSV阴性。结果表明，该批进口种公猪没有感染PRRSV。表1 种公猪血样650 nm下的吸光值Table 1 OD 650 of boars blood samples1234567891011120.0670.0910.1010.0780.0660.0740.1090.1170.0830.0890.1080.086A0.1360.0970.0750.0810.1260.0780.0820.0720.1230.0810.2410.083B0.0840.0840.0970.0730.1110.2540.0890.0820.1060.0790.0750.083C0.0740.0710.0690.0410.1480.0930.0780.0890.040.0820.0610.105D0.260.0650.0570.0640.0910.0630.0860.0670.0680.0390.0440.061E0.0940.0620.1310.0940.070.090.0840.0740.1130.2030.2730.057F0.1090.0890.1690.0690.0410.1250.0870.0870.0730.0680.0840.721G0.0810.0620.0770.0980.0730.0860.0850.210.070.1440.0690.758H表2 种公猪血样的 S/P值Table 2 S/P values of boars blood samples1234567891011120.01 0.05 0.06 0.03 0.01 0.02 0.07 0.09 0.04 0.04 0.07 0.04 A0.11 0.06 0.02 0.03 0.10 0.03 0.03 0.02 0.09 0.03 0.27 0.04 B0.04 0.04 0.06 0.02 0.08 0.29 0.04 0.03 0.07 0.03 0.02 0.04 C0.02 0.02 0.01 -0.03 0.13 0.05 0.03 0.04 -0.03 0.03 0.00 0.07 D0.30 0.01 0.00 0.01 0.05 0.01 0.04 0.01 0.01 -0.03 -0.02 0.00 E0.05 0.00 0.11 0.05 0.02 0.05 0.04 0.02 0.08 0.21 0.31 0.00 F0.07 0.04 0.16 0.01 -0.03 0.10 0.04 0.04 0.02 0.01 0.04 0.97 G0.03 0.00 0.03 0.06 0.02 0.04 0.04 0.22 0.02 0.12 0.01 1.03 H2.2荧光RT-PCR结果本文采用荧光实时定量RT-PCR方法对江苏B猪场和浙江Z猪场2个猪场的6批212份样品进行了检测，结果见图2～7，共检出PRRSV阳性样品9份（a、c、e、f、g、i、k、l、m），占所检样品的4.2%；其中江苏B猪场3批样品PRRSV阳性率为分别为10%、11.8%和2.2%（图2～4，表3），浙江Z猪场3批送检血样只有第一批PRRSV阳性率为10%，其余2批均为PRRSV阴性（图5～7，表4）。结果表明，江苏B猪场有感染PRRSV的情况，但在可控制范围内，经过一段时间的治疗有所好转。浙江Z猪场同样存在PRRSV感染的情况，经过一段时间的净化，可判定PRRSV为阴性。图2 江苏B猪场第一批血样RT-PCR检测结果Fig. 2 Results of first batch of blood samples from the B pig farm in Jiangsu detected by RT-PCR图3 江苏B猪场第二批血样RT-PCR检测结果Fig. 3 Results of second batch of blood samples from the B pig farm in Jiangsu detected by RT-PCR图4 江苏B猪场第三批血样RT-PCR检测结果Fig. 4 Results of third batch of blood samples from the B pig farm in Jiangsu detected by RT-PCR图5 浙江Z猪场第一批血样RT-PCR检测结果Fig. 5 Results of first batch of blood samples from the Z pig farm in Zhejiang detected by RT-PCR图6 浙江Z猪场第二批血样RT-PCR检测结果Fig. 6 Results of second batch of blood samples from the Z pig farm in Zhejiang detected by RT-PCR图7 浙江Z猪场第三批血样RT-PCR检测结果Fig. 7 Results of third batch of blood samples from the Z pig farm in Zhejiang detected by RT-PCR表3 江苏B猪场3批血样PRRSV RT-PCR检测结果Table 3 Results of three batch of blood samples from the B pig farm in Jiangsu for PRRSV detected by RT-PCR表4 浙江Z猪场3批血样PRRSV RT-PCR检测结果Table 4 Results of three batch of blood samples from the Z pig farm in Zhejiang for PRRSV detected by RT-PCR3 讨论 3.1 猪繁殖与呼吸综合征猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的猪的一种繁殖障碍和呼吸系统的传染病。该病在世界范围内广泛流行，给世界养猪业带来了巨大的经济损失。早在20世纪80年代初至90年代初，在北美和欧洲流行以猪繁殖障碍和呼吸道疾病为主要特征的新型疾病，经初步研究确定为动脉炎病毒感染所致，以其临床特征命名为猪繁殖和呼吸综合征病毒[1]。美国于1987年爆发该病，1997年出现超强毒力型变异株，接种过猪繁殖与呼吸综合征弱毒疫苗的猪同样发病，母猪流产率10％~20％，病死率20％，有中枢神经症状。被称为母猪流产和死亡综合征。2006年我国首次爆发由该病毒的变异株引起的“猪无名高热症”，也称蓝耳病，给我国养猪业带来了巨大的经济损失[2]。我国农业部将高致病性猪繁殖与呼吸综合征列为一类动物传染病进行防治。2007年北美爆发的猪繁殖与呼吸综合征比中国2006~2007年发生的高致病性猪繁殖与呼吸综合征还要严重，超过20％的母猪死亡，多达50％的母猪流产。猪繁殖与呼吸综合征病毒属尼多病毒目，动脉炎病毒科、动脉炎病毒属[3]，与其同属的有鼠乳酸脱氢酶病毒（LDV）、猴出血热病毒（SHFV）、马动脉炎病毒（EAV）。国内外血清学实验和基因序列分析表明，PRRSV可划分为两种基因型，即美洲型（代表毒株为ATCC VR-2332）和欧洲型（代表毒株为LV），两者核苷酸序列同源性约60％。PRRSV为不分节段，聚腺苷酸化，有囊膜的单股正链RNA病毒。病毒粒子呈球形，病毒纯化后负染电镜观察，形态清晰，直径50～65nm。核衣壳直径30～35nm，核衣壳呈二十面体对称，囊膜表面有明显的纤突[4,5]。PRRSV对有机溶剂敏感，乙醚、氯仿等有机溶剂均可灭活病毒，脱氧胆酸钠和Triton-X-100可使PRRSV失去感染力。该病毒主要有两个亚型，即美洲型和欧洲型[6]。美洲型具有更强的致病力[7]。PRRSV可以在PAM、MARC-145、CL-2621等细胞上复制，然而不是每种细胞系都适合PRRSV的生长的，这也就是说如果可能的话需要用至少二种细胞系来进行病毒的分离培养。但分离欧洲株PRRSV只能用PAM细胞[8]。PRRSV可以在多种临床样品中分离得到，其中包括血清、血浆、外周血单核细胞、骨髓、扁桃体、肺、淋巴结、脾、胸腺、心、脑、肝、睾丸、输精管等，其中血清和肺灌洗液最适合病毒分离。PRRSV在血清中存在比组织中稳定，而老龄动物由于病毒血症的时间短，则病毒在组织中存在的时间长。组织必须及时送检才能保证病毒分离的成功。样品的选择同时也要根据感染的阶段(急性感染期、康复期、持续感染期)，在急性感染期，选择血清、肺、肺灌洗液作为样品比较好，而持续感染的动物则选择口、鼻棉拭以及肺灌洗液较好[9]。 2006年以来，虽然高致病性蓝耳病在我国大流行，国内目前所报道的分离株仅为美洲株，尚未见欧洲株的报道，但随着频繁的进出口贸易，欧洲株很可能会传入我国，必须提高警惕，防止该病毒从国外传入。因此，必须通过间接ELISA、RT-PCR等技术加强进出口检验检疫[10]。此外，由于猪繁殖与呼吸综合征缺乏特征性的发病症状，易于其他病原混合感染，给临床诊断增大了难度[11]。在养殖过程中，耐过猪可长期带毒并不断向外界排毒，造成的持续性感染不利于猪场的健康发展[12]。因此，需要实验室检测特定病原以助确诊，同时在猪场引进种猪时也应严格把关，起到净化猪场的效果[13]。3.2 PRRSV检测方法目前检测PRRSV的常用方法有ELISA、病毒分离、RT-PCR等。病毒分离操作烦琐，成本较高，周期较长，并且对病料的要求较高。间接ELISA是检测PRRSV感染的常规方法，该方法敏感性高，检测快速，利用猪繁殖与呼吸综合征病毒抗体检测试剂盒配合先进的光谱扫描多功能读数仪，可以非常高效的完成整个检测，送检样品24 h内可以得出检测报告。Albina等(1992)[14]开发的用于检测生长在PAM细胞上的抗原的ELISA得到了广泛应用，其方法是将PRRSV接种PAM上培养，制备阳性抗原，并用相同的方法制备模拟抗原。当阳性抗原孔的OD值与模拟抗原孔的OD值之比大于1.5时判断样品为阳性。对试验感染猪血清和从未暴发本病地区采集的猪血清进行抗体检查，证实ELISA的敏感性、特异性和符合率均比IPMA高，而且早期抗体的检测比用IPMA更为敏感，法国已将ELISA作为监测和诊断本病的常见方法。常用的有Dot-ELISA、阻断ELISA，因其敏感性高、经济、快速，适用于短期内大批量血清样品的检测。最近，ELISA又有新报道，许立华等[15]利用PRRSV核衣壳蛋白基因的原核表达产物，分别建立了检测PRRS抗体的间接ELISA方法及乳胶凝集试验，与美国IDEXX公司研制的ELISA试剂盒相比，检出符合率分别为78%和91%。此法避免了以活病毒作为抗原检测时造成的散毒现象。夏向荣等[16]以PRRSV核衣壳蛋白(N蛋白)基因的原核表达产物重组N蛋白为包被抗原，利用兔抗重组N蛋白血清和PRRS猪血清竞争该抗原，建立间接竞争ELISA方法检测PRRS抗体。该方法特异性强，稳定性和重复性好，整个检测过程可在3h内完成。以IDEXX试剂盒的检测结果为参照标准，该方法的敏感性为79.76%，特异性为90.9%，符合率为83.59%。将该方法按试剂盒要求标准化，4℃放置5个月，检测效果不变。江云波等[17]，利用谷胱甘肽-S-转移酶(GST)表达系统将PRRSV的ORF5和ORF6基因依序串联于GST下游，并在大肠杆菌中成功表达，获得了大小约为相对分子质量60000的融合蛋白，以纯化的融合蛋白为抗原建立了PRRS P56-ELISA检测方法，与国外试剂盒IDEXX-ELISA总符合率为94.1%，表明建立的P56-ELISA检测方法具有很好的特异性和敏感性。陈义平等[18]用亲和层析纯化的PRRSV重组核衣壳蛋白GST-N作为诊断抗原，建立PRRS检测血清抗体的间接ELISA方法。与HerdChek ELISA相比，间接ELISA的敏感性为94.5%，特异性为91.3%，总符合率为92.9%，Youden指数为0.86。同时还证明该方法具有良好的批间和批内重复性，并且不与猪瘟、猪伪狂犬病等阳性血清发生反应。顾小雪等[19]利用GST-GP5AB重组蛋白作为包被抗原，通过反应条件优化，建立了用于检测PRRSV抗体的间接ELISA方法。该抗原与猪其他4种临床症状类似的疾病的阳性血清反应呈阴性。批内和批间重复性试验结果，变异系数均小于7%，表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用本方法初步检测了一些疫苗免疫仔猪血清样品，并与重组N蛋白和PRRSV抗原同时进行比较，结果显示3种抗原检测的结果基本一致。 经免疫过的猪群可能在一段时间内使用间接ELISA的样品可能出现假阳性的情况，可以将检测为阳性的样品再次进行RT-PCR检测以确实。其原理是将重组的PRRSV 抗原包被在微孔滴定板上，被测样品在包被孔中孵育时，针对PRRSV的特异性抗体与包被的抗原形成抗原抗体复合物，洗去包被孔中没有结合的成分后，加入辣根过氧化物酶（HRPO）标记的抗猪抗体，它与孔中的猪抗体结合，在试验的最后步骤，洗去没有结合的酶标抗体，再加入酶底物和显色剂TMB，颜色反应的深浅由样品中存在的抗PRRSV 特异性抗体的量决定。 RT-PCR简单、方便、快速，敏感，但仍然存在假阳性和PCR污染等弊端。荧光RT-PCR技术是近年来发展起来的一项快速、特异、灵敏且无EB污染的新型检测技术，其扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行，并通过微机控制，实现了对PCR扩增产物进行实时动态检测和自动分析结果。该技术从根本上解决了PCR扩增产物污染的问题，但也容易受到很多因素的干扰。现在春季传染病多发期，猪场送检样品多数为混合感染，存在同时检测多种疾病的状况，可以根据需要做多重RT-PCR进行检测确诊。送检样品数目庞大，全部进行RT-PCR时工作量过大，无法及时得出结论时，可以采取混样的方法，根据总量和养殖情况采取按圈舍为单位进行样品混样进行快速排查。 实时荧光PCR作为一项比较新颖的技术已被广泛应用于病毒性疾病的研究和临床诊断上。目前，根据采用荧光素发光原理不同，实时荧光PCR可分为SYBR染料、TaqMan、Lightcycler、Lux primer、分子信标等技术[20]。其中以TaqMan技术使用最为普遍，其特异性和敏感性方面也很高，而且原理简单。即PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团，此时5’端荧光基团吸收能量后将能量转移给临近的3’端荧光淬灭基团(发生荧光共振能量转移，FRET)，因此探针完整时，检测不到该探针5’端荧光基团发出的荧光[21]。但在PCR扩增中，溶液中的模板变性后低温退火时，引物与探针同时与模板结合。在引物的介导下，沿模板向前延伸至探针结合处，发生链的置换，Taq酶的5’-3’外切酶活性，将探针5’端连接的荧光基团从探针上切割下来，游离于反应体系中，从而脱离3’端荧光淬灭基团的屏蔽，接受光刺激发出荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此探针对于扩增片段上的碱基突变很敏感，如果在探针结合区域有一个碱基突变，就会使特异性和敏感性发生严重的降低（通常可降低数百倍甚至上千倍），严重时可直接影响检测结果的真实性，造成假阴性的结果[22]。在Real-time PCR反应过程中，首先需设定一个荧光信号的域值(threshold)，一般以PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号(baseline)。荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。如果检测到的荧光信号超过域值被认为是真正的信号，它可用于定义样本的域值循环数(Ct)。Ct值的含义是每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。在Real-time PCR中，模板定量有两种策略相对定量和绝对定量。相对定量指的是在一定样本中靶序列相对于另一参照样本的量的变化。绝对定量指的是用已知的标准曲线来推算未知的样本的量。本研究中，我们采用绝对定量的方法，将质粒和病毒滴度作为绝对定量标准品，根据260nm的吸光度值并用DNA或RNA的分子量来转换成其拷贝数来确定。综上所述，本文所采用的检测PRRSV的间接ELISA和荧光RT-PCR方法敏感性高，特异性强，操作方便快速，而且不容易造成分子生物学方面的污染，是PRRSV诊断和监测及肉品安全检测的有效手段。3.3 检测结果分析猪繁殖与呼吸综合征是危害我国养猪业的重大传染病，为了防控该病，一是要防止从国外引入该病，二是要加强本病的检测，净化猪场。因此，江苏B猪场将引进的92头种公猪血样送检，经过本实验用ELISA检测均为阴性，说明引进的种公猪未感染PRRSV，在引种过程中杜绝了该病的流入。此外，江苏B猪场和浙江Z猪场将发病猪血样分三批送检，经过本实验用荧光RT-PCR方法检测，部分样品PRRSV阳性，表明该猪场不同程度感染了PRRSV，病原得到确诊。经过确诊后，该猪场进行针对该病的治疗，取得了较好的效果。通过间接ELISA和荧光RT-PCR的检测，快速有效的检测出PRRSV，指导猪场在引种时把关，在养殖中监测，对发病猪及时做出正确的反应，可起到缩短病程，淘汰带毒种猪的作用。长此以往，猪场可以在养殖过程中一步步的得到净化，减少不必要的经济损失。致谢参考文献[1]黎先伟, Nauwynck H. 猪蓝耳病(PRRS)—过去、现在和未来. 兽医导刊[J]. 2015, (01):56-57.[2]谭诗文. 高致病性猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)的研究进展. 贵州农业科学[J]. 2009(06):149-154.[3] Helmi Mardassiardassi. 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目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2引言 3
1 材料与方法4
1.1 材料与主要试剂 4
1.2样品采集 4
1.3 间接ELISA5
1.4 荧光RTPCR5
1.4.1引物与探针设计5
1.4.2 RNA的提取和cDNA的合成6
1.4.3荧光RTPCR6
2 结果6
2.1间接ELISA结果6
2.2荧光RTPCR结果7
3 讨论 11
3.1猪繁殖与呼吸综合征11
3.2 PRRSV检测方法12
3.3检测结果分析14
致谢14
参考文献14
附录 安佑云疾病自助诊断系统使用情况调查表9
猪繁殖与呼吸综合征的检测
引言
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