猪肺炎支原体冻干疫苗耐热保护剂的筛选
当前，耐热冻干保护剂在兽用冻干活疫苗中的研究和应用是国内生物制品行业中的热点领域。本文对猪肺炎支原体冻干疫苗的耐热保护剂进行筛选，以获得较为理想的具有良好耐热保护作用的配方。通过选取7组常用且经过优化的配方与抗原（168株）按照一定的比例（1:1）混合，选取本实验室最优冻干参数制定冻干曲线，经过预冻、一次干燥和解吸干燥，压塞后出舱，选取外观满足要求的产品，加盖铝帽、封蜡，于真空干燥箱（500Pa）测量样品残水含量。将产品放置在37℃10天后测量滴度，S3-T1配方的滴度下降为1Log，表明耐热保护剂对活菌具有良好的耐热保护作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1仪器2
1.1.2耗材2
1.1.3试剂2
1.1.4菌种2
1.2方法2
1.2.1试剂配制2
1.2.2配苗方法3
1.2.3冻干程序3
1.2.4形态特征3
1.2.5残水测定4
1.2.6耐老化试验4
1.2.7菌体含量测定4
2结果与分析4
2.1形态观察4
2.1.1疫苗形态4
2.1.2配方优化5
2.2残余水分5
2.3耐老化和菌体含量6
3讨论 6
3.1理化性质 6
3.2菌体含量 7
致谢7
参考文献8
附录A 耐热保护剂配方9
图1 干燥曲线3
图2 样品形态照片5
表1 一次干燥程序3
表2 样品分装4
表3 残余水分含量5
表4 CCU结果 6
猪肺炎支原体冻干疫苗耐热保护剂的筛选
引言
猪支原体肺炎又名猪地方流行性肺炎（SEP），俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道传染病[1]。猪肺炎支原体一般不会导致猪只大量死亡，但是 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
被感染的猪群表现为生长发育不良、饲料转化率降低、死亡率上升，容易受到细菌或病毒的二次感染[2]，造成严重的经济损失[3]。目前药物治疗容易造成药物的残留，且容易导致耐药性，故疫苗成为重要的预防手段。
市场广泛使用的是常规全菌体苗，尚无成功的亚单位苗，主要是因为猪肺炎支原体的特异保护性抗原不稳定[3]。通过肌肉注射的灭活苗由于使用方便而且免疫效果良好，所以我国临床较为常用。国内自主研发注册的猪肺炎支原体活疫苗有两个,分别为中国兽医药品监察所研究开发的猪肺炎支原体活疫苗(RM48株)和江苏省农科院畜牧兽医研究所研究开发的猪支原体肺炎活疫苗(168株)。随着冷冻干燥技术广泛应用于食品和医药行业[4]，目前市场也出现猪肺炎支原体的冷冻干燥活疫苗，其中兽药监察所研发的RM48株即为冻干活疫苗[5]。冷冻干燥技术是将液体产品放置于真空低温环境中，利用真空条件下固态水升华来除去大部分水分，由于该过程是在低温环境中进行，而且加入了大量的抗冻保护剂，所以蛋白等药用活性成分不会发生改变[6]。冻干疫苗在某种惰性气体的保护下，配方中加入了能够稳定疫苗蛋白的物质[7]，所以不论是在低温还是常温下放置都非常的稳定，保质期更长，不易变质，该工艺能够有效制备诸多蛋白活性物质且对产品的性状和效价产生重要的影响，所以在生物制品的研究中具有重要地位[8]，具有巨大的经济价值。耐热保护冻干法目前被广泛用于制备疫苗，已经通过此方法获得了诸多性能优良的药物产品。国外进口疫苗多采用此工艺，通过该方法获得的疫苗具有长期的稳定性，可在28℃保存1236个月。但由于进口疫苗费用高昂，对我国的毒株的针对性较差，保护剂的研究和配方属于保密资料，故不适用于我国的养殖业[9]。此外，国内耐热保护配方中常用的保护剂主要为牛奶、蔗糖、明胶等，虽然其外形稳定、易溶性良好、成本低廉、保存方便，但其热稳定性和保护功能差，而且产品对冷链的要求高。2～8 ℃条件下，保存期只有 3～6 个月，大多需要在15 ℃以下保存，这给疫苗的储存和运输带来很大的困难，使成本和价格居高不下。随着研究不断的深入，诸多物质被开发应用于耐热保护剂，如新型纳米颗粒[10]，高聚物[11]和表面活性剂[12]，这些物质可以显著提高疫苗的耐热保护性能以及在冷冻过程中有效保护生物活性物质[13]。通过对冻干工艺的优化，加入新的物质并调试到适当的物质浓度，可以提高抗原物质的耐热性能和稳定性[14]，并且可以获得性质稳定的（佐剂与抗原混合）疫苗[15]。本研究旨在通过对支原体冻干疫苗耐热保护剂配方的筛选和优化，从而获得外观形态良好、可以在高温条件下储存较长时间、免疫性能良好、能够快速复溶的冻干疫苗，以缓解市场上支原体疫苗品种较少的现象，解决疫苗不耐热、全程需要冷链的问题，有效预防支原体肺炎的危害，降低经济损失。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 仪器 冷冻干燥机，美国VirTis adVantage Plus、DZF型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司、FA2004电子精密天平，LIANG PING、压盖机、高压锅、干烤箱、烘箱等。
1．1．2 耗材 盐水瓶、蜀牛牌试剂瓶、纱布、枪头等高压烘干待用、美国Millipore一次性针头过滤器、山东省药用玻璃股份有限公司产5ml低硼硅胶玻璃管制注射剂瓶、江苏华兰药用新材料股份有限公司生产的注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞、石蜡。
1．1．3 试剂 蔗糖（上海将来试剂）、聚乙烯吡咯烷酮K30（沃凯）、明胶（上海将来试剂）、乙二胺四乙酸二钠盐（上海将来试剂）、甘露醇（北京鼎国昌盛生物公司）、普鲁兰糖（将来试剂）、Dextran40（Genview公司）、谷氨酸钠（将来试剂）、磷酸氢二钾（上海凌峰试剂）、磷酸二氢钾（西陇化工公司）、胎牛血清蛋白BSA（南京中诺公司）、甲硫氨酸（生兴生物公司）、双蒸水。
1．1．4 试验用菌种 猪肺炎支原体168株F120代次，由南京天邦生物科技有限公司生产管理部提供。
1．2 方法
根据中华人民共和国兽用生物制品规程（2010版）的要求，良好的耐热保护剂要满足良好的形态、较低的残水含量（≤4%） 、较低的滴度损失并且要通过耐老化试验。故试验方法如下：
1．2．1 试剂配制 将试剂分为可高压部分A和不可高压部分B，由于两者物质热稳定性不同，故采用不同的除菌方法。其中A为蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、EDTA (乙二胺四乙酸二钠盐)、甘露醇、普鲁兰糖、Dextran40；B为谷氨酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、BSA、甲硫氨酸。A部分称量后用双蒸水溶解，然后定容至50mL，110℃高压20min，4℃保存备用；B部分称量溶解后定容至50mL，用一次性针头过滤器过滤，4℃保存备用。将保存于4℃待用的A、B两部分等体积混匀，即为耐热保护剂。A、B各物质含量见附录A。
1．2．2 疫苗配置方法 将耐热保护剂和菌体按照1:1混匀，在无菌操作的前提下，分装到注射剂瓶中，每瓶2mL，盖上瓶塞，留出升华通道。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料2
1.1.1仪器2
1.1.2耗材2
1.1.3试剂2
1.1.4菌种2
1.2方法2
1.2.1试剂配制2
1.2.2配苗方法3
1.2.3冻干程序3
1.2.4形态特征3
1.2.5残水测定4
1.2.6耐老化试验4
1.2.7菌体含量测定4
2结果与分析4
2.1形态观察4
2.1.1疫苗形态4
2.1.2配方优化5
2.2残余水分5
2.3耐老化和菌体含量6
3讨论 6
3.1理化性质 6
3.2菌体含量 7
致谢7
参考文献8
附录A 耐热保护剂配方9
图1 干燥曲线3
图2 样品形态照片5
表1 一次干燥程序3
表2 样品分装4
表3 残余水分含量5
表4 CCU结果 6
猪肺炎支原体冻干疫苗耐热保护剂的筛选
引言
猪支原体肺炎又名猪地方流行性肺炎（SEP），俗称猪气喘病，是由猪肺炎支原体引起的一种慢性呼吸道传染病[1]。猪肺炎支原体一般不会导致猪只大量死亡，但是 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
被感染的猪群表现为生长发育不良、饲料转化率降低、死亡率上升，容易受到细菌或病毒的二次感染[2]，造成严重的经济损失[3]。目前药物治疗容易造成药物的残留，且容易导致耐药性，故疫苗成为重要的预防手段。
市场广泛使用的是常规全菌体苗，尚无成功的亚单位苗，主要是因为猪肺炎支原体的特异保护性抗原不稳定[3]。通过肌肉注射的灭活苗由于使用方便而且免疫效果良好，所以我国临床较为常用。国内自主研发注册的猪肺炎支原体活疫苗有两个,分别为中国兽医药品监察所研究开发的猪肺炎支原体活疫苗(RM48株)和江苏省农科院畜牧兽医研究所研究开发的猪支原体肺炎活疫苗(168株)。随着冷冻干燥技术广泛应用于食品和医药行业[4]，目前市场也出现猪肺炎支原体的冷冻干燥活疫苗，其中兽药监察所研发的RM48株即为冻干活疫苗[5]。冷冻干燥技术是将液体产品放置于真空低温环境中，利用真空条件下固态水升华来除去大部分水分，由于该过程是在低温环境中进行，而且加入了大量的抗冻保护剂，所以蛋白等药用活性成分不会发生改变[6]。冻干疫苗在某种惰性气体的保护下，配方中加入了能够稳定疫苗蛋白的物质[7]，所以不论是在低温还是常温下放置都非常的稳定，保质期更长，不易变质，该工艺能够有效制备诸多蛋白活性物质且对产品的性状和效价产生重要的影响，所以在生物制品的研究中具有重要地位[8]，具有巨大的经济价值。耐热保护冻干法目前被广泛用于制备疫苗，已经通过此方法获得了诸多性能优良的药物产品。国外进口疫苗多采用此工艺，通过该方法获得的疫苗具有长期的稳定性，可在28℃保存1236个月。但由于进口疫苗费用高昂，对我国的毒株的针对性较差，保护剂的研究和配方属于保密资料，故不适用于我国的养殖业[9]。此外，国内耐热保护配方中常用的保护剂主要为牛奶、蔗糖、明胶等，虽然其外形稳定、易溶性良好、成本低廉、保存方便，但其热稳定性和保护功能差，而且产品对冷链的要求高。2～8 ℃条件下，保存期只有 3～6 个月，大多需要在15 ℃以下保存，这给疫苗的储存和运输带来很大的困难，使成本和价格居高不下。随着研究不断的深入，诸多物质被开发应用于耐热保护剂，如新型纳米颗粒[10]，高聚物[11]和表面活性剂[12]，这些物质可以显著提高疫苗的耐热保护性能以及在冷冻过程中有效保护生物活性物质[13]。通过对冻干工艺的优化，加入新的物质并调试到适当的物质浓度，可以提高抗原物质的耐热性能和稳定性[14]，并且可以获得性质稳定的（佐剂与抗原混合）疫苗[15]。本研究旨在通过对支原体冻干疫苗耐热保护剂配方的筛选和优化，从而获得外观形态良好、可以在高温条件下储存较长时间、免疫性能良好、能够快速复溶的冻干疫苗，以缓解市场上支原体疫苗品种较少的现象，解决疫苗不耐热、全程需要冷链的问题，有效预防支原体肺炎的危害，降低经济损失。
1 材料与方法
1．1 材料
1．1．1 仪器 冷冻干燥机，美国VirTis adVantage Plus、DZF型真空干燥箱，上海一恒科技有限公司、FA2004电子精密天平，LIANG PING、压盖机、高压锅、干烤箱、烘箱等。
1．1．2 耗材 盐水瓶、蜀牛牌试剂瓶、纱布、枪头等高压烘干待用、美国Millipore一次性针头过滤器、山东省药用玻璃股份有限公司产5ml低硼硅胶玻璃管制注射剂瓶、江苏华兰药用新材料股份有限公司生产的注射用冷冻干燥无菌粉末用氯化丁基橡胶塞、石蜡。
1．1．3 试剂 蔗糖（上海将来试剂）、聚乙烯吡咯烷酮K30（沃凯）、明胶（上海将来试剂）、乙二胺四乙酸二钠盐（上海将来试剂）、甘露醇（北京鼎国昌盛生物公司）、普鲁兰糖（将来试剂）、Dextran40（Genview公司）、谷氨酸钠（将来试剂）、磷酸氢二钾（上海凌峰试剂）、磷酸二氢钾（西陇化工公司）、胎牛血清蛋白BSA（南京中诺公司）、甲硫氨酸（生兴生物公司）、双蒸水。
1．1．4 试验用菌种 猪肺炎支原体168株F120代次，由南京天邦生物科技有限公司生产管理部提供。
1．2 方法
根据中华人民共和国兽用生物制品规程（2010版）的要求，良好的耐热保护剂要满足良好的形态、较低的残水含量（≤4%） 、较低的滴度损失并且要通过耐老化试验。故试验方法如下：
1．2．1 试剂配制 将试剂分为可高压部分A和不可高压部分B，由于两者物质热稳定性不同，故采用不同的除菌方法。其中A为蔗糖、聚乙烯吡咯烷酮、明胶、EDTA (乙二胺四乙酸二钠盐)、甘露醇、普鲁兰糖、Dextran40；B为谷氨酸钠、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、BSA、甲硫氨酸。A部分称量后用双蒸水溶解，然后定容至50mL，110℃高压20min，4℃保存备用；B部分称量溶解后定容至50mL，用一次性针头过滤器过滤，4℃保存备用。将保存于4℃待用的A、B两部分等体积混匀，即为耐热保护剂。A、B各物质含量见附录A。
1．2．2 疫苗配置方法 将耐热保护剂和菌体按照1:1混匀，在无菌操作的前提下，分装到注射剂瓶中，每瓶2mL，盖上瓶塞，留出升华通道。
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