过硫酸氢钾复合盐颗粒对鸡新城疫病毒的杀灭试验
：过硫酸氢钾复合盐作为一种集广谱、高效、安全、绿色、环保于一体的兽用复方消毒剂，有效杀灭各种病原微生物且不受有机物影响，副作用小，其代谢产物对人和动物、环境危害较小。本研究通过选择鸡新城疫弱病毒为目标毒株，设定不同浓度的过硫酸氢钾复合盐颗粒，在实验室环境下研究其对新城疫病毒的杀灭作用，为临床研究提供科学依据。实验结果表明，供试消毒剂按5g/L（1:200稀释）、2.5g/L（1:400稀释）、 1g/L（1:1000稀释）使用对鸡新城疫病毒有较好的消毒效果。关键字：过硫酸氢钾复合盐；消毒剂；杀菌效果The Inactivated Test of Peroxymonosulfate Particles to NDVsStudent majoring in Veterinary Medicine Gao XuepingTutor Yu ZugongAbstract: Peroxymonosulfate is a veterinary compound disinfectant of broad spectrum. It is efficient, safe, green and has environmental protection . It can kill a variety of pathogenic microorganisms effectively without side effects. Peroxymonosulfate does less damage to people, animals and environment. This study chose weak Newcastle disease virus strains as the aim, and set different concentrations of peroxymonosulfate particles, in the laboratory environment to study the germicidal efficacy on NDVs, thus to provide the scientific basis for clinical study. The experimental results show that the test disinfect
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ant diluted to 5g/L (1:200), 2.5 g/L (1:400), 1g/L (1:1000) have great germicidal efficacy on Newcastle disease virus. 当前畜牧业发展停滞不前的主要原因是畜禽疫病，是由细菌、病毒等病原体引起的具有传染性和流行性的一类危害严重的动物性疫病。一些重大的畜禽传染病对一个国家或地区的打击往往都是致命性的，不仅给畜牧业生产造成巨大的经济损失，还直接威胁人类健康和经济发展[1]，因此有效控制动物疫病发生迫在眉睫。目前我国主张“预防为主，防治结合”的方针。消毒是预防的首要措施，是现代养殖生产中动物健康管理体系中心内容和保障，它贯穿于养殖业的全过程，是实现生物安全，提供优质安全性动物性食品的关键环节[2]。通常利用消毒剂对畜禽（包括动物体表皮肤粘膜和体表浅体腔）及其周围环境进行消毒，以杀灭传播媒介上的病原微生物，切断传播途径，达到防止疾病发生、蔓延，进而控制和消灭传染病的目的，彻底、规范的消毒是动物疾病预防及控制较有效、方便的方法手段。当前因养殖环境差引起的传染病频发，使我国畜牧业遭受巨大经济损失，甚至直接威胁到人类的健康。对畜禽及其周围环境进行消毒是杀灭饲养环境中病原体最有效的方法之一，因而有必要研发一种杀菌谱广，作用速度快，性质稳定，安全性高，价格低廉的优良消毒剂[3]。本项目对已研发的过硫酸氢钾复合盐颗粒消毒剂拟开展实验室微生物杀灭试验。选择《兽用消毒剂鉴定技术规范》（试行）中规定的代表性病原体作为试验病毒，严格按照技术规范进行，对过硫酸氢钾复合盐颗粒消毒剂的杀菌、消毒效能进行系统的研究，为其在临床推广应用提供理论依据和数据支撑。1.试验材料1.1试验动物普通非免疫鸡胚：9~10日龄，由江苏省农科院兽医研究所家禽重大疫病防控研究室提供。1.2试验药物兽药名称：过硫酸氢钾复合盐颗粒对照药物：杜邦卫可LOT：1411BA0027，由烟台金海药业有限公司提供。中和剂：1%的硫代硫酸钠溶液。1.3试剂和仪器电热恒温培养箱：DNP-9162A，上海光都仪器设备有限公司；电热恒温水槽：DK-8D型，上海一恒科技有限公司；二级生物安全柜：BIOⅡA，西班牙泰事达公司；超净工作台：SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司；立式压力蒸汽灭菌器：LS-B50L，上海华线医用核子仪器有限公司；普兰德移液器（排枪）：Transferpette?S-8，德国Brand公司。鸡新城疫病毒La Sota株（NDV）：1000羽份/瓶，每羽份病毒含量不低于106EID50（egg infectious dose），购自南京天邦生物科技有限公司。2、试验方法2.1 消毒液及试剂配制消毒液配制：由蒸馏水稀释至所需要浓度。对照药物配制：由蒸馏水稀释至所需要浓度。中和剂配制：用灭菌生理盐水配制1%的硫代硫酸钠溶液。灭菌生理盐水配制：氯化钠9 g，用蒸馏水溶解，加至1000 mL，分装，115℃、15 min高压灭菌，备用。pH7.2磷酸缓冲液（PBS）配制：氯化钠8.0 g，氯化钾0.2 g，磷酸氢二钠1.44 g，磷酸二氢钾0.24 g，加蒸馏水至1000 mL。将各成分依次溶解，用盐酸调pH至7.2，分装，115℃、15 min高压灭菌，备用。1%红细胞悬液配制：采集非免疫鸡的抗凝血，放入离心管中，加入4倍体积的PBS混匀，2000 r/min离心10 min，去掉血浆和白细胞层，重复离心，反复洗涤3次，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1%的悬液，4℃保存备用。2.2鸡新城疫病毒EID50的测定2.2.1病毒的稀释 取鸡新城疫病毒La Sota株（NDV)用灭菌的生理盐水做连续10倍稀释：10-1、10-2、10-3······10-9，混合均匀，备用。2.2.2鸡胚尿囊腔接种 取9～10日龄活鸡胚，分成4组（取10-6、10-7、10-8、10-9四个稀释度），每组5枚，在蛋壳上分别作上标记。用照蛋器照检后划出气室边界，在胚胎距气室边界上2～3cm处避开血管做圆形标记，先用碘酒擦拭消毒，再用酒精消毒，再在标记处用蛋钻打小孔，分别注入各稀释浓度的病毒液0.1ml，石蜡封口后置37℃恒温箱中培养，每日照检1次，24 h内弃去死胚。2.2.3 观察鸡胚感染情况 24 h后每天用照蛋器照检这4组鸡胚，一旦发现鸡胚血管不清楚或脱落、胚内浑浊、胚体不动等情况视为鸡胚感染或死亡。观察至120 h，记录各组鸡胚感染及死亡情况，结合HA测定结果，计算各稀释度鸡胚发生感染的百分率。2.2.4血凝效价测定（HA） 取96孔板，做好标记，用微量移液器在1孔～12孔每孔加入25μLPBS；吸取25μL病毒悬液加入第1孔中，吹打3～5次，充分混匀；从第1孔中吸取25 μL混匀后的病毒液加到第2孔，混匀后吸取25 μL加到第3孔，依次进行系列倍比稀释到11孔，最后从第11孔吸取25 μL弃去，第12孔设为阴性对照；每孔再加入25 μL PBS；每孔加入25 μL体积分数为1%的鸡红细胞悬液；振荡混匀反应混合液，37℃温箱内静置30min后观察红细胞凝集结果[4]。2.2.5 计算EID50 EID50的计算采用Reed-Muench法，如下：lgEID50=高于50%的稀释度的对数+×稀释系数的对数。2.3中和剂验证试验2.3.1分组概况 以新城疫病毒La Sota株（NDV）为试验菌株进行中和剂鉴定试验。准备足量的试管和平皿，依次进行编号。将消毒剂配制好后，置20℃水浴中待用，再将NDV稀释至2×105EID50/mL试管中，置20℃水浴中备用。 试验按以下分组进行[5]：第1组：消毒剂+病毒液：证明消毒剂在试验浓度下是否有杀灭新城疫病毒作用。 第2组：中和剂+病毒液：证明中和剂有无杀灭新城疫病毒作用。第3组：（消毒剂+中和剂）+病毒液：证明中和剂能有效中和消毒剂杀灭新城疫病毒的作用，且证明消毒剂与中和剂的反应产物有无杀灭新城疫病毒作用。第4组：病毒液：证明新城疫病毒是否能在鸡胚内正常增殖。第5组：中和剂：证明中和剂对鸡胚无影响。 加样方式参照“2.5 定性杀灭NDV试验”，每种药物组合分别取5 min混合液接种鸡胚，共5组，每组接种鸡胚10枚。2.3.2 观察鸡胚感染情况 24 h后每天用照蛋器照检这5组鸡胚，一旦发现鸡胚血管不清楚或脱落、胚内浑浊、胚体不动等情况视为鸡胚感染或死亡。观察至120 h，记录各组鸡胚感染及死亡情况，结合HA测定结果，计算各稀释度鸡胚发生感染的百分率，验证中和剂的选择是否合理。2.4定量杀灭NDV试验 吸取2×105EID50/mL的NDV 2.5mL置 20℃±1℃水浴保持5 min后分别加入消毒液2.5 mL的测试浓度的供试消毒剂、对照消毒剂和生理盐水（作空白对照）迅速混合，即刻计时，5min后，吸取混合液1mL加入9mL中和剂，作用10min后，按“2.2”项下方法测定各组病毒滴度。供试消毒剂的测试浓度选择四个稀释浓度：（1）1:100稀释即10g/L；（2）1:200稀释即5g/L；（3）1:400稀释即2.5g/L；（4）1:1000稀释即1g/L。对照消毒剂使用临床推荐剂量即1:200倍稀释（5g/L）进行上述试验。结果判定方法：测试消毒效能，要求其病毒灭活率达到99.9%以上，病毒灭活率计算公式如下：病毒灭活率%=2.5定性杀灭NDV试验 吸取2×105EID50/mL的NDV 2.5mL置 20℃±1℃水浴保持5 min后分别加入消毒液2.5 mL的10g/L、5g/L、2.5/L 和1g/L四个浓度的供试消毒剂、5g/L浓度下的对照消毒剂及生理盐水中（空白对照），充分摇匀，置室温（20～30℃）下，分别于5 min、10 min、20 min、30 min、60 min时吸取混合液1 mL加入9 mL中和剂，作用10 min后，接种10日龄易感鸡胚，每组接种10个，每胚尿囊内接种0.2 mL，24 h以内死亡的鸡胚去掉，观察并记录24 h以后的死胚情况。对24h后死亡的鸡胚及时取出，至120 h全部取出，对死胚和活胚逐个取尿囊液作血凝试验，测定各组病毒灭活情况。结果判定：以100%或80%鸡胚均为阴性的消毒液最低浓度为灭活NDV的有效浓度，以该浓度消毒剂灭活病毒的最低时间为最快有效时间。3、结果3.1半数感染量的测定（EID50）将病毒原液倍比稀释10个梯度，取其中的4个浓度接种鸡胚，连续培养120小时，每天照胚，测得该新城疫病毒半数感染量为10-7.84 /0.1ml，结果整理如下[6]（表1）：表1 半数感染量的测定病毒稀释度结果 累积生存数感染数生存数感染数总数感染率10-60501212100%10-71417887.5%10-83243742.9%10-94181911.1%注：距离比=（87.5-50）÷（87.5-42.9）=0.84， Lg EID50=0.84×（-1）+（-7）=-7.84EID50=10-7.84 /0.1ml3.2中和剂验证试验试验表明，用1%硫代硫酸钠（生理盐水稀释）作为中和剂能有效中和残留的消毒剂，且中和剂与中和产物对新城疫病毒和鸡胚无影响，结果见表2。表2 中和剂验证试验结果组别HA阳性个数HA阴性个数感染率（%）消毒剂+病毒液0100中和剂+病毒液100100%（消毒剂+中和剂）+病毒液100100%病毒液100100%中和剂10枚鸡胚正常存活注：在中和剂的验证试验中，参与反应的消毒剂测试浓度均为10g/L。3.3定量杀灭试验本试验结果发现，空白对照组鸡胚均感染新城疫病毒，而供试消毒剂在10g/L、5g/L、2.5/L 、1g/L和对照消毒剂组（5g/L浓度下）的消毒效果一致，均能100%杀灭病毒，鸡胚感染率为0，由此可见，供试消毒剂对新城疫病毒有高效杀灭作用， 1:1000稀释浓度（1g/L）下即可杀灭全部病毒。消毒后病毒和中和剂混合液接种鸡胚增殖后，鸡胚尿囊液新城疫病毒HA效价检测结果见表3，各组别半数感染量结果计算如下表4~表9。对病毒的灭活率结果见表10。 表3 鸡胚尿囊液的新城疫病毒HA效价检测组别病毒稀释度尿囊液HA价供试消毒剂10g/L浓度组120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-220 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂5g/L浓度组120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-220 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂2.5g/L浓度组120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-220 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂1g/L浓度组120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-220 20 20 20 20 20 20 20 20 20对照消毒剂5g/L浓度组120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-220 20 20 20 20 20 20 20 20 20空白对照组（灭菌生理盐水）10-3210 210 26 26 25 25 25 25 25 2410-4211 211 211 211 20 20 20 20 20 2010-525 24 20 20 20 20 20 20 20 20表4 10g/L的供试消毒剂组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率1100300300%10-1100200200%10-2100100100%注：EID50 = 0表5 5g/L的供试消毒剂组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率1100300300%10-1100200200%10-2100100100%注：EID50 = 0表6 2.5g/L的供试消毒剂组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率1100300300%10-1100200200%10-2100100100%注：EID50 = 0表7 1g/L的供试消毒剂浓度组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率1100300300%10-1100200200%10-2100100100%注：EID50 = 0表8 5g/L的对照消毒剂组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率1100300300%10-1100200200%10-2100100100%注：EID50 = 0表9 空白对照组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率10-301001616100%10-464661250%10-5821421612.5%注：EID50=10-4/ml表10 病毒灭活率组别消毒前病毒滴度EID50/ml消毒后病毒滴度EID50/ml病毒灭活率（%）供试消毒剂10g/L浓度组1040100供试消毒剂5g/L浓度组1040100供试消毒剂2.5g/L浓度组1040100供试消毒剂1g/L浓度组1040100对照消毒剂5g/L浓度组1040100空白对照组10410403.4定性杀灭试验不同浓度的消毒剂在反应不同时间内对病毒的灭杀具体效果可见表11。统计结果见表12。由结果可见，空白对照组鸡胚全数感染新城疫病毒。供试消毒剂在10g/L、5g/L、2.5/L、1g/L和对照消毒剂组（5g/L浓度下）的消毒效果一致，均在5min内即可杀灭所有病毒，表明该消毒剂能高效速效杀灭新城疫病毒。表11 鸡胚尿囊液中新城疫病毒HA效价(2n)检测组别反应时间鸡胚尿囊液HA价供试消毒剂10g/L浓度组5min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2010min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2020min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2030min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2060min20 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂5g/L浓度组5min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2010min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2020min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2030min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2060min20 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂2.5g/L浓度组5min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2010min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2020min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2030min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2060min20 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂1g/L浓度组5min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2010min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2020min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2030min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2060min20 20 20 20 20 20 20 20 20 20对照消毒剂5g/L浓度组5min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2010min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2020min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2030min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2060min20 20 20 20 20 20 20 20 20 20空白对照组5min210 29 29 28 27 27 25 25 25 2510min210 210 29 28 28 27 26 26 26 2420min210 210 29 29 28 28 28 27 27 2730min211 211 29 29 28 28 28 27 26 2660min210 29 29 28 28 28 28 27 27 27表12 新城疫病毒感染情况组别不同时间中NDV血凝试验阴性鸡胚数/所有鸡胚数5min10min20min30min60min供试消毒剂10g/L浓度组10/1010/1010/1010/1010/10供试消毒剂5g/L浓度组10/1010/1010/1010/1010/10供试消毒剂2.5g/L浓度组10/1010/1010/1010/1010/10供试消毒剂1g/L浓度组10/1010/1010/1010/1010/10对照消毒剂5g/L浓度组10/1010/1010/1010/1010/10空白对照组0/100/100/100/100/104、讨论病毒滴度即病毒的毒力或毒价，衡量病毒滴度的常用单位有最小致死量（MLD）、最小感染量（MID）和半数致死量（LD50），当试验材料为鸡胚时最常用鸡胚半数感染量（EID50）表示。本研究按照《中华人民共和国兽药典》2010年版三部附录7中规定方法，按照Reed-Muench法测定所购鸡新城疫病毒La Sota株对鸡胚的EID50，待用于后续试验[7]。本试验参考已报道的过硫酸氢钾复合粉消毒试验中所用中和剂，选择1%硫代硫酸钠（PBS 稀释）作为中和剂，并进了中和作用验证试验，结果证实中和剂对新城疫病毒生长无影响，且能有效中和高浓度消毒剂的残留[8]。同时考察了10g/L浓度的过硫酸氢钾复合盐颗粒和新城疫病毒作用后接种健康鸡胚，鸡胚全数存活，表明高浓度消毒剂对鸡胚生长无影响。本试验按照《兽用消毒剂鉴定技术规范》指导原则，选择规定的鸡新城疫病毒La Sota株作为目标毒株，通过定量试验和定性试验考察了过硫酸氢钾复合盐颗粒对新城疫病毒的杀灭作用[9]。定量试验中，10g/L、5g/L、2.5/L 、1g/L过硫酸氢钾复合盐颗粒与规定量的新城疫病毒作用5min后，接种鸡胚，检测消毒前后新城疫病毒的EID50，结果鸡胚感染率为0，显示100%的杀灭率。定性试验结果同样显示：10g/L、5g/L、2.5/L 、1g/L过硫酸氢钾复合盐颗粒与规定量的新城疫病毒作用5min后，接种鸡胚，检测鸡胚尿囊液中新城疫HA价，结果鸡胚感染率为0[10]。由此可见1g/L（1:1000稀释度）即可在5min内即可杀灭新城疫病毒，具有高效速效杀灭新城疫病毒能力。5、结论供试消毒剂按5g/L（1:200稀释）、2.5g/L（1:400稀释）、 1g/L（1:1000稀释）使用对鸡新城疫病毒有较好的消毒效果。致谢感谢江苏省农科院兽医研究所李银研究员、刘鲜娇师姐、徐桃师姐、孙超等给予了大量无私的指导与帮助，在此致以衷心感谢。感谢江苏省农业科学院兽医研究所家禽重大疾病防控研究室和大学动物医学院基础药理实验室在我试验过程中给予提供的便利。 感谢基础药理组郭凡溪、张珍瑞、罗小清、吴峰、郭洋、郭雪文、安冉等师兄师姐，谢雨婧、杨帆以及动医院李亮师兄、王聪师兄、闫越同学等在工作中给予的大力支持和在生活中给予的亲切关怀，本试验的顺利完成是建立在他们无私帮助基础之上的。感谢好友臧晓宁、李来武等在生活和学业上的陪伴与鼓励。 最后深深的感谢我的爸爸妈妈多年来对我的关怀和爱护，感激之情，无以言表。参考文献：[1] Pappaioanou M. 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 试验材料1
1.1 试验动物 2
1.2 试验药物 2
1.3 试剂和仪器2
2 试验方法2
2.1 消毒液及试剂配制2
2.2 鸡新城疫病毒EID50的测定2
2.2.1 病毒的稀释2
2.2.2 鸡胚尿囊腔接种2
2.2.3 观察鸡胚感染情况2
2.2.4 血凝效价测定2
2.2.5 计算EID503
2.3 中和剂验证试验3
2.3.1 分组概况3
2.3.2 观察鸡胚感染清况3
2.4 定量灭杀NDV试验3
2.5 定性灭杀NDV试验3
3 结果 4
3.1 半数感染量的测定4
3.2 中和剂验证试验4
3.3 定量灭杀试验4
3.4 定性灭杀试验6
4 讨论7
5 结论7
致谢8
参考文献8
过硫酸氢钾复合盐颗粒对鸡新城疫病毒的杀灭试验
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
ant diluted to 5g/L (1:200), 2.5 g/L (1:400), 1g/L (1:1000) have great germicidal efficacy on Newcastle disease virus. 当前畜牧业发展停滞不前的主要原因是畜禽疫病，是由细菌、病毒等病原体引起的具有传染性和流行性的一类危害严重的动物性疫病。一些重大的畜禽传染病对一个国家或地区的打击往往都是致命性的，不仅给畜牧业生产造成巨大的经济损失，还直接威胁人类健康和经济发展[1]，因此有效控制动物疫病发生迫在眉睫。目前我国主张“预防为主，防治结合”的方针。消毒是预防的首要措施，是现代养殖生产中动物健康管理体系中心内容和保障，它贯穿于养殖业的全过程，是实现生物安全，提供优质安全性动物性食品的关键环节[2]。通常利用消毒剂对畜禽（包括动物体表皮肤粘膜和体表浅体腔）及其周围环境进行消毒，以杀灭传播媒介上的病原微生物，切断传播途径，达到防止疾病发生、蔓延，进而控制和消灭传染病的目的，彻底、规范的消毒是动物疾病预防及控制较有效、方便的方法手段。当前因养殖环境差引起的传染病频发，使我国畜牧业遭受巨大经济损失，甚至直接威胁到人类的健康。对畜禽及其周围环境进行消毒是杀灭饲养环境中病原体最有效的方法之一，因而有必要研发一种杀菌谱广，作用速度快，性质稳定，安全性高，价格低廉的优良消毒剂[3]。本项目对已研发的过硫酸氢钾复合盐颗粒消毒剂拟开展实验室微生物杀灭试验。选择《兽用消毒剂鉴定技术规范》（试行）中规定的代表性病原体作为试验病毒，严格按照技术规范进行，对过硫酸氢钾复合盐颗粒消毒剂的杀菌、消毒效能进行系统的研究，为其在临床推广应用提供理论依据和数据支撑。1.试验材料1.1试验动物普通非免疫鸡胚：9~10日龄，由江苏省农科院兽医研究所家禽重大疫病防控研究室提供。1.2试验药物兽药名称：过硫酸氢钾复合盐颗粒对照药物：杜邦卫可LOT：1411BA0027，由烟台金海药业有限公司提供。中和剂：1%的硫代硫酸钠溶液。1.3试剂和仪器电热恒温培养箱：DNP-9162A，上海光都仪器设备有限公司；电热恒温水槽：DK-8D型，上海一恒科技有限公司；二级生物安全柜：BIOⅡA，西班牙泰事达公司；超净工作台：SW-CJ-1F，苏州安泰空气技术有限公司；立式压力蒸汽灭菌器：LS-B50L，上海华线医用核子仪器有限公司；普兰德移液器（排枪）：Transferpette?S-8，德国Brand公司。鸡新城疫病毒La Sota株（NDV）：1000羽份/瓶，每羽份病毒含量不低于106EID50（egg infectious dose），购自南京天邦生物科技有限公司。2、试验方法2.1 消毒液及试剂配制消毒液配制：由蒸馏水稀释至所需要浓度。对照药物配制：由蒸馏水稀释至所需要浓度。中和剂配制：用灭菌生理盐水配制1%的硫代硫酸钠溶液。灭菌生理盐水配制：氯化钠9 g，用蒸馏水溶解，加至1000 mL，分装，115℃、15 min高压灭菌，备用。pH7.2磷酸缓冲液（PBS）配制：氯化钠8.0 g，氯化钾0.2 g，磷酸氢二钠1.44 g，磷酸二氢钾0.24 g，加蒸馏水至1000 mL。将各成分依次溶解，用盐酸调pH至7.2，分装，115℃、15 min高压灭菌，备用。1%红细胞悬液配制：采集非免疫鸡的抗凝血，放入离心管中，加入4倍体积的PBS混匀，2000 r/min离心10 min，去掉血浆和白细胞层，重复离心，反复洗涤3次，最后吸取压积红细胞用PBS配成体积分数为1%的悬液，4℃保存备用。2.2鸡新城疫病毒EID50的测定2.2.1病毒的稀释 取鸡新城疫病毒La Sota株（NDV)用灭菌的生理盐水做连续10倍稀释：10-1、10-2、10-3······10-9，混合均匀，备用。2.2.2鸡胚尿囊腔接种 取9～10日龄活鸡胚，分成4组（取10-6、10-7、10-8、10-9四个稀释度），每组5枚，在蛋壳上分别作上标记。用照蛋器照检后划出气室边界，在胚胎距气室边界上2～3cm处避开血管做圆形标记，先用碘酒擦拭消毒，再用酒精消毒，再在标记处用蛋钻打小孔，分别注入各稀释浓度的病毒液0.1ml，石蜡封口后置37℃恒温箱中培养，每日照检1次，24 h内弃去死胚。2.2.3 观察鸡胚感染情况 24 h后每天用照蛋器照检这4组鸡胚，一旦发现鸡胚血管不清楚或脱落、胚内浑浊、胚体不动等情况视为鸡胚感染或死亡。观察至120 h，记录各组鸡胚感染及死亡情况，结合HA测定结果，计算各稀释度鸡胚发生感染的百分率。2.2.4血凝效价测定（HA） 取96孔板，做好标记，用微量移液器在1孔～12孔每孔加入25μLPBS；吸取25μL病毒悬液加入第1孔中，吹打3～5次，充分混匀；从第1孔中吸取25 μL混匀后的病毒液加到第2孔，混匀后吸取25 μL加到第3孔，依次进行系列倍比稀释到11孔，最后从第11孔吸取25 μL弃去，第12孔设为阴性对照；每孔再加入25 μL PBS；每孔加入25 μL体积分数为1%的鸡红细胞悬液；振荡混匀反应混合液，37℃温箱内静置30min后观察红细胞凝集结果[4]。2.2.5 计算EID50 EID50的计算采用Reed-Muench法，如下：lgEID50=高于50%的稀释度的对数+×稀释系数的对数。2.3中和剂验证试验2.3.1分组概况 以新城疫病毒La Sota株（NDV）为试验菌株进行中和剂鉴定试验。准备足量的试管和平皿，依次进行编号。将消毒剂配制好后，置20℃水浴中待用，再将NDV稀释至2×105EID50/mL试管中，置20℃水浴中备用。 试验按以下分组进行[5]：第1组：消毒剂+病毒液：证明消毒剂在试验浓度下是否有杀灭新城疫病毒作用。 第2组：中和剂+病毒液：证明中和剂有无杀灭新城疫病毒作用。第3组：（消毒剂+中和剂）+病毒液：证明中和剂能有效中和消毒剂杀灭新城疫病毒的作用，且证明消毒剂与中和剂的反应产物有无杀灭新城疫病毒作用。第4组：病毒液：证明新城疫病毒是否能在鸡胚内正常增殖。第5组：中和剂：证明中和剂对鸡胚无影响。 加样方式参照“2.5 定性杀灭NDV试验”，每种药物组合分别取5 min混合液接种鸡胚，共5组，每组接种鸡胚10枚。2.3.2 观察鸡胚感染情况 24 h后每天用照蛋器照检这5组鸡胚，一旦发现鸡胚血管不清楚或脱落、胚内浑浊、胚体不动等情况视为鸡胚感染或死亡。观察至120 h，记录各组鸡胚感染及死亡情况，结合HA测定结果，计算各稀释度鸡胚发生感染的百分率，验证中和剂的选择是否合理。2.4定量杀灭NDV试验 吸取2×105EID50/mL的NDV 2.5mL置 20℃±1℃水浴保持5 min后分别加入消毒液2.5 mL的测试浓度的供试消毒剂、对照消毒剂和生理盐水（作空白对照）迅速混合，即刻计时，5min后，吸取混合液1mL加入9mL中和剂，作用10min后，按“2.2”项下方法测定各组病毒滴度。供试消毒剂的测试浓度选择四个稀释浓度：（1）1:100稀释即10g/L；（2）1:200稀释即5g/L；（3）1:400稀释即2.5g/L；（4）1:1000稀释即1g/L。对照消毒剂使用临床推荐剂量即1:200倍稀释（5g/L）进行上述试验。结果判定方法：测试消毒效能，要求其病毒灭活率达到99.9%以上，病毒灭活率计算公式如下：病毒灭活率%=2.5定性杀灭NDV试验 吸取2×105EID50/mL的NDV 2.5mL置 20℃±1℃水浴保持5 min后分别加入消毒液2.5 mL的10g/L、5g/L、2.5/L 和1g/L四个浓度的供试消毒剂、5g/L浓度下的对照消毒剂及生理盐水中（空白对照），充分摇匀，置室温（20～30℃）下，分别于5 min、10 min、20 min、30 min、60 min时吸取混合液1 mL加入9 mL中和剂，作用10 min后，接种10日龄易感鸡胚，每组接种10个，每胚尿囊内接种0.2 mL，24 h以内死亡的鸡胚去掉，观察并记录24 h以后的死胚情况。对24h后死亡的鸡胚及时取出，至120 h全部取出，对死胚和活胚逐个取尿囊液作血凝试验，测定各组病毒灭活情况。结果判定：以100%或80%鸡胚均为阴性的消毒液最低浓度为灭活NDV的有效浓度，以该浓度消毒剂灭活病毒的最低时间为最快有效时间。3、结果3.1半数感染量的测定（EID50）将病毒原液倍比稀释10个梯度，取其中的4个浓度接种鸡胚，连续培养120小时，每天照胚，测得该新城疫病毒半数感染量为10-7.84 /0.1ml，结果整理如下[6]（表1）：表1 半数感染量的测定病毒稀释度结果 累积生存数感染数生存数感染数总数感染率10-60501212100%10-71417887.5%10-83243742.9%10-94181911.1%注：距离比=（87.5-50）÷（87.5-42.9）=0.84， Lg EID50=0.84×（-1）+（-7）=-7.84EID50=10-7.84 /0.1ml3.2中和剂验证试验试验表明，用1%硫代硫酸钠（生理盐水稀释）作为中和剂能有效中和残留的消毒剂，且中和剂与中和产物对新城疫病毒和鸡胚无影响，结果见表2。表2 中和剂验证试验结果组别HA阳性个数HA阴性个数感染率（%）消毒剂+病毒液0100中和剂+病毒液100100%（消毒剂+中和剂）+病毒液100100%病毒液100100%中和剂10枚鸡胚正常存活注：在中和剂的验证试验中，参与反应的消毒剂测试浓度均为10g/L。3.3定量杀灭试验本试验结果发现，空白对照组鸡胚均感染新城疫病毒，而供试消毒剂在10g/L、5g/L、2.5/L 、1g/L和对照消毒剂组（5g/L浓度下）的消毒效果一致，均能100%杀灭病毒，鸡胚感染率为0，由此可见，供试消毒剂对新城疫病毒有高效杀灭作用， 1:1000稀释浓度（1g/L）下即可杀灭全部病毒。消毒后病毒和中和剂混合液接种鸡胚增殖后，鸡胚尿囊液新城疫病毒HA效价检测结果见表3，各组别半数感染量结果计算如下表4~表9。对病毒的灭活率结果见表10。 表3 鸡胚尿囊液的新城疫病毒HA效价检测组别病毒稀释度尿囊液HA价供试消毒剂10g/L浓度组120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-220 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂5g/L浓度组120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-220 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂2.5g/L浓度组120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-220 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂1g/L浓度组120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-220 20 20 20 20 20 20 20 20 20对照消毒剂5g/L浓度组120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-120 20 20 20 20 20 20 20 20 2010-220 20 20 20 20 20 20 20 20 20空白对照组（灭菌生理盐水）10-3210 210 26 26 25 25 25 25 25 2410-4211 211 211 211 20 20 20 20 20 2010-525 24 20 20 20 20 20 20 20 20表4 10g/L的供试消毒剂组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率1100300300%10-1100200200%10-2100100100%注：EID50 = 0表5 5g/L的供试消毒剂组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率1100300300%10-1100200200%10-2100100100%注：EID50 = 0表6 2.5g/L的供试消毒剂组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率1100300300%10-1100200200%10-2100100100%注：EID50 = 0表7 1g/L的供试消毒剂浓度组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率1100300300%10-1100200200%10-2100100100%注：EID50 = 0表8 5g/L的对照消毒剂组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率1100300300%10-1100200200%10-2100100100%注：EID50 = 0表9 空白对照组EID50计算病毒稀释度结果累积生存数感染数生存数感染数总数感染率10-301001616100%10-464661250%10-5821421612.5%注：EID50=10-4/ml表10 病毒灭活率组别消毒前病毒滴度EID50/ml消毒后病毒滴度EID50/ml病毒灭活率（%）供试消毒剂10g/L浓度组1040100供试消毒剂5g/L浓度组1040100供试消毒剂2.5g/L浓度组1040100供试消毒剂1g/L浓度组1040100对照消毒剂5g/L浓度组1040100空白对照组10410403.4定性杀灭试验不同浓度的消毒剂在反应不同时间内对病毒的灭杀具体效果可见表11。统计结果见表12。由结果可见，空白对照组鸡胚全数感染新城疫病毒。供试消毒剂在10g/L、5g/L、2.5/L、1g/L和对照消毒剂组（5g/L浓度下）的消毒效果一致，均在5min内即可杀灭所有病毒，表明该消毒剂能高效速效杀灭新城疫病毒。表11 鸡胚尿囊液中新城疫病毒HA效价(2n)检测组别反应时间鸡胚尿囊液HA价供试消毒剂10g/L浓度组5min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2010min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2020min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2030min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2060min20 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂5g/L浓度组5min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2010min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2020min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2030min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2060min20 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂2.5g/L浓度组5min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2010min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2020min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2030min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2060min20 20 20 20 20 20 20 20 20 20供试消毒剂1g/L浓度组5min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2010min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2020min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2030min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2060min20 20 20 20 20 20 20 20 20 20对照消毒剂5g/L浓度组5min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2010min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2020min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2030min20 20 20 20 20 20 20 20 20 2060min20 20 20 20 20 20 20 20 20 20空白对照组5min210 29 29 28 27 27 25 25 25 2510min210 210 29 28 28 27 26 26 26 2420min210 210 29 29 28 28 28 27 27 2730min211 211 29 29 28 28 28 27 26 2660min210 29 29 28 28 28 28 27 27 27表12 新城疫病毒感染情况组别不同时间中NDV血凝试验阴性鸡胚数/所有鸡胚数5min10min20min30min60min供试消毒剂10g/L浓度组10/1010/1010/1010/1010/10供试消毒剂5g/L浓度组10/1010/1010/1010/1010/10供试消毒剂2.5g/L浓度组10/1010/1010/1010/1010/10供试消毒剂1g/L浓度组10/1010/1010/1010/1010/10对照消毒剂5g/L浓度组10/1010/1010/1010/1010/10空白对照组0/100/100/100/100/104、讨论病毒滴度即病毒的毒力或毒价，衡量病毒滴度的常用单位有最小致死量（MLD）、最小感染量（MID）和半数致死量（LD50），当试验材料为鸡胚时最常用鸡胚半数感染量（EID50）表示。本研究按照《中华人民共和国兽药典》2010年版三部附录7中规定方法，按照Reed-Muench法测定所购鸡新城疫病毒La Sota株对鸡胚的EID50，待用于后续试验[7]。本试验参考已报道的过硫酸氢钾复合粉消毒试验中所用中和剂，选择1%硫代硫酸钠（PBS 稀释）作为中和剂，并进了中和作用验证试验，结果证实中和剂对新城疫病毒生长无影响，且能有效中和高浓度消毒剂的残留[8]。同时考察了10g/L浓度的过硫酸氢钾复合盐颗粒和新城疫病毒作用后接种健康鸡胚，鸡胚全数存活，表明高浓度消毒剂对鸡胚生长无影响。本试验按照《兽用消毒剂鉴定技术规范》指导原则，选择规定的鸡新城疫病毒La Sota株作为目标毒株，通过定量试验和定性试验考察了过硫酸氢钾复合盐颗粒对新城疫病毒的杀灭作用[9]。定量试验中，10g/L、5g/L、2.5/L 、1g/L过硫酸氢钾复合盐颗粒与规定量的新城疫病毒作用5min后，接种鸡胚，检测消毒前后新城疫病毒的EID50，结果鸡胚感染率为0，显示100%的杀灭率。定性试验结果同样显示：10g/L、5g/L、2.5/L 、1g/L过硫酸氢钾复合盐颗粒与规定量的新城疫病毒作用5min后，接种鸡胚，检测鸡胚尿囊液中新城疫HA价，结果鸡胚感染率为0[10]。由此可见1g/L（1:1000稀释度）即可在5min内即可杀灭新城疫病毒，具有高效速效杀灭新城疫病毒能力。5、结论供试消毒剂按5g/L（1:200稀释）、2.5g/L（1:400稀释）、 1g/L（1:1000稀释）使用对鸡新城疫病毒有较好的消毒效果。致谢感谢江苏省农科院兽医研究所李银研究员、刘鲜娇师姐、徐桃师姐、孙超等给予了大量无私的指导与帮助，在此致以衷心感谢。感谢江苏省农业科学院兽医研究所家禽重大疾病防控研究室和大学动物医学院基础药理实验室在我试验过程中给予提供的便利。 感谢基础药理组郭凡溪、张珍瑞、罗小清、吴峰、郭洋、郭雪文、安冉等师兄师姐，谢雨婧、杨帆以及动医院李亮师兄、王聪师兄、闫越同学等在工作中给予的大力支持和在生活中给予的亲切关怀，本试验的顺利完成是建立在他们无私帮助基础之上的。感谢好友臧晓宁、李来武等在生活和学业上的陪伴与鼓励。 最后深深的感谢我的爸爸妈妈多年来对我的关怀和爱护，感激之情，无以言表。参考文献：[1] Pappaioanou M. 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目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 试验材料1
1.1 试验动物 2
1.2 试验药物 2
1.3 试剂和仪器2
2 试验方法2
2.1 消毒液及试剂配制2
2.2 鸡新城疫病毒EID50的测定2
2.2.1 病毒的稀释2
2.2.2 鸡胚尿囊腔接种2
2.2.3 观察鸡胚感染情况2
2.2.4 血凝效价测定2
2.2.5 计算EID503
2.3 中和剂验证试验3
2.3.1 分组概况3
2.3.2 观察鸡胚感染清况3
2.4 定量灭杀NDV试验3
2.5 定性灭杀NDV试验3
3 结果 4
3.1 半数感染量的测定4
3.2 中和剂验证试验4
3.3 定量灭杀试验4
3.4 定性灭杀试验6
4 讨论7
5 结论7
致谢8
参考文献8
过硫酸氢钾复合盐颗粒对鸡新城疫病毒的杀灭试验
引言
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