鸭肝炎病毒的分离与鉴定
鸭肝炎病毒的分离与鉴定[20200507215947]
摘要：鸭肝炎病毒是一种高致死性、高传播性的病毒性传染病病原，临床主要引起急性肝炎，主要侵害3周龄以内的雏鸭，尤以1周龄内的雏鸭为甚，病死率高达100%。20世纪以来,鸭肝炎已成为危害中国养鸭业最为严重的疫病之一，给养鸭业带来了巨大的经济损失。本试验从死于疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织进行病原分离，通过鸡胚尿囊腔接种、病毒培养、病毒毒性测定、RT-PCR鉴定、血凝性测定及动物回归试验，表明分离到的病毒株为Ⅰ型鸭肝炎病毒，命名为JS02株，其致死率高达 80%，感染鸭可出现鸭病毒性肝炎的典型病变。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:鸭肝炎病毒；分离；鉴定；RT-PCR
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1材料与方法2
1.1病料与标准毒株 2
1.2 试验动物 2
1.3 试剂与培养基2
1.4 兔抗Ⅰ型DHV标准阳性血清及分离株高免血清制备2
1.5 细菌分离2
1.6 病毒分离与增值2
1.6.1 尿囊腔接种方法2
1.6.2 尿囊液的收取方法3
1.6.3 病毒鸡胚培养3
1.7 病毒毒价（ELD50）的测定3
1.8 RT-PCR鉴定3
1.8.1 RNA的提取3
1.8.2 反转录3
1.8.3 PCR4
1.8.4 电泳缓冲液50×TAE Buffer配制方法4
1.8.5 1.5％凝胶制备4
1.8.6 电泳运行4
1.9 病毒血凝性测定 4
1.10 动物回归实验 4
2结果与分析 5
2.1 细菌分离 5
2.2 病毒分离与增殖 5
2.3 病毒毒价（ELD50）测定 5
2.4 RT-PCR鉴定 5
2.5 病毒血凝性测定 6
2.6 动物回归实验 6
3讨论 6
致谢7
参考文献7鸭肝炎病毒的分离与鉴定
引言
鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）是由在血清学上具有明显差异，无交叉免疫的DHV-I、DHV-II和DHV-III型三种不 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
同病原引起的，其中 DHV-I型病毒呈世界范围性分布[1]。所以通常所说的鸭肝炎主要是指Ⅰ型鸭肝炎，其病毒致死性最强，主要发生于雏鸭，临床表现为发病急、传播快、病程短、死亡率高，主要有痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状；肝肿胀和出血为其特征性病变[2]，是一种具有急性、高度接触性和致死性的传染性疾病，主要危害7日龄～20日龄雏鸭，其病死率高达80%[3]，给养鸭业造成很大的危害。
黄均建在 1963年首次报道上海爆发了 DHV-I，接着在我国北京、福建和江浙陆续有相关报道本病的爆发[4-6]。1999 年苏敬良等在北京和广西等地在3-13日龄疑似鸭肝炎的北京鸭和樱桃谷鸭上分离到两株与 I 型和 III 型 DHV无血清学交叉免疫反应的 DHV，认为出现了新的血清型，并将其命名为新型鸭肝炎病毒[7]。
近年来我国养鸭业得到了迅速的发展，成为世界养鸭大国，饲养方式也由粗放型转变为集约型，饲养密度加大，使得水禽的生长环境恶化，降低了鸭群的免疫力，同时也利于病毒在个体之间的传播且提高了病毒变异几率，使得国内许多地区出现鸭肝炎A型弱毒疫苗免疫的鸭群爆发鸭肝炎的报道，因而严重制约了养鸭业的发展。
本研究拟对疑似鸭病毒性肝炎病发病鸭的病料进行病原分离与鉴定，为防治鸭病毒性肝炎提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 病料与标准毒株
疑似鸭病毒性肝炎病料来自江苏的发病鸭（分离株命名为JS02）；DHV标准毒株（W株，Ⅰ型）来自江苏省农业科学院。
1.2 试验动物
经检测无DVH母源抗体的鸭胚、雏鸭以及SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.3 试剂与培养基
RT-PCR反应所需的试剂（rTaq DNA 聚合酶（5 UμL-1）、dNTP、DNA Maker DL2000等）均购自大连宝生物工程有限公司；普通琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板均按配方自制。
1.4 兔抗Ⅰ型DHV 标准阳性血清及分离株高免血清制备
用鸭肝炎标准毒株及分离株的鸡胚尿囊液毒，以3000 rmin-1 离心30 min，分别取上清液加等量弗氏完全佐剂混匀乳化制成油乳剂，皮下注射2只成年家兔，1mL只-1。2周后以病毒液与等量弗氏不完全佐剂制成油乳剂于皮下注射，1mL只-1。第4周后再以无佐剂病毒0.2、0.4、0.8mL递增剂量1周分3次耳缘静脉注射。5周后采血，在37℃温箱中感作30min，4℃放置过夜，分离血清，3000 rmin-1 离心30 min，取上清，测定其效价，置-80℃保存备用。
1.5 细菌分离
从病死鸭肝脏无菌操作取样接种于普通琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板，于37℃恒温箱中培养，观察有无细菌生长。
1.6 病毒分离及增殖
1.6.1尿囊腔接种方法：
选9～11日龄鸡胚
①?先观察鸡胚发育情况：照蛋，取血管丰满者。
②?划出气室位置。
③?离气室边缘下部5mm避开大血管作一记号，定为注射入口。
④?消毒打孔：记号处和气室顶端各打一孔，先用碘酊再用酒精消毒，由顶部由里至外。
⑤?吸取病料，由注射入口小孔刺入3～5mm，注射0.2ml病毒，拔出 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
针头，以石蜡涂布注射孔，石蜡封闭两孔(先封下面，再封上面)。
⑥?蛋壳注明日期，姓名以及病毒名称。
⑦?置37℃温箱中孵育（相对湿度保持在45%～60% ）24h内死亡或血管不清者(病料未增殖)弃去，以后每日照蛋两次，死胚置4℃冰箱保存，144h不死者将其冻死。血管冻后会收缩。
⑧?冷冻后收获尿囊液。
1.6.2?尿囊液的收取方法
气室消毒→击破气室卵壳并弃去→无菌小镊撕去壳膜→再撕绒毛尿膜(不撕破羊膜）→用镊子轻轻按住胚胎，无菌吸管吸取尿囊液置无菌青霉素瓶中→冷冻保存、备用，并写上姓名及病毒名称（DHV）。
1.6.3病毒鸡胚培养
将采集的病鸭肝脏在灭菌的研钵内充分研磨，用灭菌生理盐水制成l∶5悬液，冻融3次，3000rmin-1 离心30min，取上清液，加2000 IUmL-1青霉素、2000 IUmL-1链霉素，37℃作用30min。取9日龄SPF鸡胚20枚，分为2组，每组l0枚，第1组为试验组，经尿囊腔途径接种病料，0.2mL胚-1；第2组为对照组，经尿囊腔途径接种无菌生理盐水，0.2mL胚-1。接种后继续孵化，每天照蛋2次，收获24～144 h死亡胚尿囊液，冷冻保存、备用，观察胚体及内脏病变。
1.7 病毒毒价（ELD50）测定
取标准毒株和分离毒株鸡胚尿囊液毒分别作l0-1～l0-9稀释，每个稀释度接种8枚9日龄鸭胚，0.2mL枚-1，观察7d，记录鸭胚死亡情况。根据死胚的时间和数量按Reed-Muench法计算ELD50。
1.8 RT-PCR 鉴定
应用本实验室建立的Ⅰ型鸭肝炎病毒RT-PCR诊断方法对分离病毒进行鉴定。
RT-PCR特异性扩增引物：
Vp1上游引物：5-ATCAGGGTGATTCCAACCAG-3
下游引物：5- TTGGTCTGATTCAATTTCCA-3
摘要：鸭肝炎病毒是一种高致死性、高传播性的病毒性传染病病原，临床主要引起急性肝炎，主要侵害3周龄以内的雏鸭，尤以1周龄内的雏鸭为甚，病死率高达100%。20世纪以来,鸭肝炎已成为危害中国养鸭业最为严重的疫病之一，给养鸭业带来了巨大的经济损失。本试验从死于疑似鸭病毒性肝炎的病鸭肝组织进行病原分离，通过鸡胚尿囊腔接种、病毒培养、病毒毒性测定、RT-PCR鉴定、血凝性测定及动物回归试验，表明分离到的病毒株为Ⅰ型鸭肝炎病毒，命名为JS02株，其致死率高达 80%，感染鸭可出现鸭病毒性肝炎的典型病变。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
关键字:鸭肝炎病毒；分离；鉴定；RT-PCR
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）2
1材料与方法2
1.1病料与标准毒株 2
1.2 试验动物 2
1.3 试剂与培养基2
1.4 兔抗Ⅰ型DHV标准阳性血清及分离株高免血清制备2
1.5 细菌分离2
1.6 病毒分离与增值2
1.6.1 尿囊腔接种方法2
1.6.2 尿囊液的收取方法3
1.6.3 病毒鸡胚培养3
1.7 病毒毒价（ELD50）的测定3
1.8 RT-PCR鉴定3
1.8.1 RNA的提取3
1.8.2 反转录3
1.8.3 PCR4
1.8.4 电泳缓冲液50×TAE Buffer配制方法4
1.8.5 1.5％凝胶制备4
1.8.6 电泳运行4
1.9 病毒血凝性测定 4
1.10 动物回归实验 4
2结果与分析 5
2.1 细菌分离 5
2.2 病毒分离与增殖 5
2.3 病毒毒价（ELD50）测定 5
2.4 RT-PCR鉴定 5
2.5 病毒血凝性测定 6
2.6 动物回归实验 6
3讨论 6
致谢7
参考文献7鸭肝炎病毒的分离与鉴定
引言
鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus，DHV）是由在血清学上具有明显差异，无交叉免疫的DHV-I、DHV-II和DHV-III型三种不 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
同病原引起的，其中 DHV-I型病毒呈世界范围性分布[1]。所以通常所说的鸭肝炎主要是指Ⅰ型鸭肝炎，其病毒致死性最强，主要发生于雏鸭，临床表现为发病急、传播快、病程短、死亡率高，主要有痉挛、抽搐和角弓反张等神经症状；肝肿胀和出血为其特征性病变[2]，是一种具有急性、高度接触性和致死性的传染性疾病，主要危害7日龄～20日龄雏鸭，其病死率高达80%[3]，给养鸭业造成很大的危害。
黄均建在 1963年首次报道上海爆发了 DHV-I，接着在我国北京、福建和江浙陆续有相关报道本病的爆发[4-6]。1999 年苏敬良等在北京和广西等地在3-13日龄疑似鸭肝炎的北京鸭和樱桃谷鸭上分离到两株与 I 型和 III 型 DHV无血清学交叉免疫反应的 DHV，认为出现了新的血清型，并将其命名为新型鸭肝炎病毒[7]。
近年来我国养鸭业得到了迅速的发展，成为世界养鸭大国，饲养方式也由粗放型转变为集约型，饲养密度加大，使得水禽的生长环境恶化，降低了鸭群的免疫力，同时也利于病毒在个体之间的传播且提高了病毒变异几率，使得国内许多地区出现鸭肝炎A型弱毒疫苗免疫的鸭群爆发鸭肝炎的报道，因而严重制约了养鸭业的发展。
本研究拟对疑似鸭病毒性肝炎病发病鸭的病料进行病原分离与鉴定，为防治鸭病毒性肝炎提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 病料与标准毒株
疑似鸭病毒性肝炎病料来自江苏的发病鸭（分离株命名为JS02）；DHV标准毒株（W株，Ⅰ型）来自江苏省农业科学院。
1.2 试验动物
经检测无DVH母源抗体的鸭胚、雏鸭以及SPF鸡胚，购自北京梅里亚维通实验动物技术有限公司。
1.3 试剂与培养基
RT-PCR反应所需的试剂（rTaq DNA 聚合酶（5 UμL-1）、dNTP、DNA Maker DL2000等）均购自大连宝生物工程有限公司；普通琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板均按配方自制。
1.4 兔抗Ⅰ型DHV 标准阳性血清及分离株高免血清制备
用鸭肝炎标准毒株及分离株的鸡胚尿囊液毒，以3000 rmin-1 离心30 min，分别取上清液加等量弗氏完全佐剂混匀乳化制成油乳剂，皮下注射2只成年家兔，1mL只-1。2周后以病毒液与等量弗氏不完全佐剂制成油乳剂于皮下注射，1mL只-1。第4周后再以无佐剂病毒0.2、0.4、0.8mL递增剂量1周分3次耳缘静脉注射。5周后采血，在37℃温箱中感作30min，4℃放置过夜，分离血清，3000 rmin-1 离心30 min，取上清，测定其效价，置-80℃保存备用。
1.5 细菌分离
从病死鸭肝脏无菌操作取样接种于普通琼脂平板、巧克力琼脂平板、麦康凯琼脂平板，于37℃恒温箱中培养，观察有无细菌生长。
1.6 病毒分离及增殖
1.6.1尿囊腔接种方法：
选9～11日龄鸡胚
①?先观察鸡胚发育情况：照蛋，取血管丰满者。
②?划出气室位置。
③?离气室边缘下部5mm避开大血管作一记号，定为注射入口。
④?消毒打孔：记号处和气室顶端各打一孔，先用碘酊再用酒精消毒，由顶部由里至外。
⑤?吸取病料，由注射入口小孔刺入3～5mm，注射0.2ml病毒，拔出 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
针头，以石蜡涂布注射孔，石蜡封闭两孔(先封下面，再封上面)。
⑥?蛋壳注明日期，姓名以及病毒名称。
⑦?置37℃温箱中孵育（相对湿度保持在45%～60% ）24h内死亡或血管不清者(病料未增殖)弃去，以后每日照蛋两次，死胚置4℃冰箱保存，144h不死者将其冻死。血管冻后会收缩。
⑧?冷冻后收获尿囊液。
1.6.2?尿囊液的收取方法
气室消毒→击破气室卵壳并弃去→无菌小镊撕去壳膜→再撕绒毛尿膜(不撕破羊膜）→用镊子轻轻按住胚胎，无菌吸管吸取尿囊液置无菌青霉素瓶中→冷冻保存、备用，并写上姓名及病毒名称（DHV）。
1.6.3病毒鸡胚培养
将采集的病鸭肝脏在灭菌的研钵内充分研磨，用灭菌生理盐水制成l∶5悬液，冻融3次，3000rmin-1 离心30min，取上清液，加2000 IUmL-1青霉素、2000 IUmL-1链霉素，37℃作用30min。取9日龄SPF鸡胚20枚，分为2组，每组l0枚，第1组为试验组，经尿囊腔途径接种病料，0.2mL胚-1；第2组为对照组，经尿囊腔途径接种无菌生理盐水，0.2mL胚-1。接种后继续孵化，每天照蛋2次，收获24～144 h死亡胚尿囊液，冷冻保存、备用，观察胚体及内脏病变。
1.7 病毒毒价（ELD50）测定
取标准毒株和分离毒株鸡胚尿囊液毒分别作l0-1～l0-9稀释，每个稀释度接种8枚9日龄鸭胚，0.2mL枚-1，观察7d，记录鸭胚死亡情况。根据死胚的时间和数量按Reed-Muench法计算ELD50。
1.8 RT-PCR 鉴定
应用本实验室建立的Ⅰ型鸭肝炎病毒RT-PCR诊断方法对分离病毒进行鉴定。
RT-PCR特异性扩增引物：
Vp1上游引物：5-ATCAGGGTGATTCCAACCAG-3
下游引物：5- TTGGTCTGATTCAATTTCCA-3
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