黑猩猩肠道内阿米巴原虫的分离培养及形态观察
自1875年Feder Losch首次在人体发现阿米巴原虫病以后，已有9种不同种属的阿米巴被先后发现，灵长类动物是阿米巴原虫的易感动物，该类原虫多寄生于动物机体的肠道和肝脏内，以滋养体形式侵袭机体，引发阿米巴痢疾和肝脓肿[1]。2015年对动物园送检的黑猩猩粪便内检测出阿米巴包囊，经过形态学鉴定为迪斯帕内阿米巴（Entamoeba dispar）和结肠内阿米巴(Entamoeba coli Grassi)。对其进行营养琼脂双向培养基进行分离培养后，仅发现迪斯帕内阿米巴滋养体，并对其进行形态学观察。
目录
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1.1 材料 2
1.1.1 主要仪器设备 2
1.1.2 粪样采集 2
1.1.3 培养基配制 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 粪样处理 2
1.2.2 分离培养 2
1.2.3 形态观察 2
2 结果与分析 2
2.1 粪便中阿米巴包囊及囊后滋养体 2
2.1.1 未成熟的迪斯帕内阿米巴包囊 2
2.1.2 成熟的迪斯帕内阿米巴包囊 3
2.1.3 成熟的结肠内阿米巴包囊 3
2.1.4 其他囊后滋养体与包囊 4
2.2 培养基中阿米巴包囊 4
2.3 培养基中阿米巴滋养体 4
3 讨论 5
3.1形态学讨论 5
3.2 结肠内阿米巴与迪斯帕内阿米巴活力强弱讨论 6
3.3 虫体体外培养讨论 6
致谢 6
参考文献 6
黑猩猩肠道内阿米巴原虫的分离培养及形态观察
引言
阿米巴原虫属肉足鞭毛门(Sarcomastiug ophora)。叶足纲(Lobosasida)、阿米巴目(Amoebida)。由于生活环境不同可分为内阿米巴和自由生活阿米巴, 前者寄生于人和动物, 主要有4个属, 内阿米巴属(Entamoeba)、内蜒属(Endolimax )、嗜碘 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
阿米巴属(Iodamoeba) 和脆双核阿米巴属(Dientamoeba)；后者生活在水和泥土中，偶尔侵入动物机体，主要有5个属，即耐格里属(Naegleria)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、哈曼属(Hartmannella)、Vablkampfia 属和Sappinia属[2]。
现已知内阿米巴属的溶组织内阿米巴会引发阿米巴痢疾和肝脓肿，耐格里属和棘阿米巴属主要引起脑膜脑炎、角膜炎、口腔感染和皮肤损伤等。临床上,，溶组织内阿米巴引发的病例多，感染面广，危害大。因此，不同种肠道阿米巴的形态观察及鉴别在临床诊断上有着重要意义。
溶组织内阿米巴生活周期中有两个主要时期，即滋养体时期和包囊期。滋养体时期是摄食、活动和增殖的生活时期。滋养体可借助伪足的机械运动和水解酶作用入侵肠壁组织，或经血液循环移至肝脏和其他器官，吞噬红细胞和组织细胞，破坏和溶解组织，并在组织内增殖形成包囊，然后将包囊经粪便排出体外。包囊期是具有保护性外壁的生活阶段，多在宿主粪便和分泌物中找到，无致病性，当其发育成四核包囊时，就成为感染性包囊，被宿主吞食后，会在组织中继续发育形成滋养体。其生活史归结起来就是“包囊滋养体包囊”的循环过程[23]。
迪斯帕内阿米巴与溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)形态相似、生活史相同，从形态上无法鉴定，常误诊。结肠内阿米巴直径略大于溶组织内阿米巴，在我国与其平行分布，发现时有必要继续寻找后者。对动物园圈养黑猩猩粪便镜检发现阿米巴原虫包囊，用药后病愈。现采集该黑猩猩慢性感染期粪便进行形态学鉴定，发现该黑猩猩为结肠内阿米巴和迪斯帕内阿米巴混合感染。经分离培养，培养成迪斯帕内阿米巴滋养体，并对其进行形态观察，为日后镜检鉴定提供依据，并为其分子学鉴定提供虫体原料。
1 材料与方法
材料
主要仪器设备 显微镜，生物安全柜，260目筛，离心机，冰箱，恒温培养箱等。
粪样采集 粪样取自动物园猩猩馆圈养的黑猩猩。取黑猩猩新鲜粪便50g左右于小烧杯中待处理。
培养基配制 本实验采用经杨光友等人改良后的营养琼脂双相培养基。在1000mL蒸馏水中加入8gNaCl，0.2gKCl，0.2gCaCl2，0.01gMgCl2，2gNa2HPO4，KH2HPO4。CaCl2和MgCl2分装于不同的容器其他液体部分同装一个容器，高温灭菌，冷却，混匀，取500mL加入1.5g牛肉浸膏，2.5g蛋白胨，7.5g琼脂。沸水浴2~3h，完全溶解，残渣可用四层纱布过滤除去，并趁热将滤液用试管分装，每管5mL，高温灭菌，放成斜面，备用。剩余500mL液体保留。接种前，每管加B部分液体4.5mL和猴子血清0.5mL，灭菌米粉20mg，青霉素1000单位，链霉素2000单位[4]。
实验方法
粪样处理 向载玻片中央滴一滴碘液，用牙签沾取少许粪样混于碘液中，混匀后加以盖玻片，等待5min后于显微镜下直接镜检，观察是否有碘染的阿米巴包囊，拍照，观察形态，测量大小，做初步鉴定。向盛有粪便的小烧杯中加入适量蒸馏水，搅拌至混合溶解均匀，结合260目筛及漏斗过滤。将滤液于离心机中3000r/min离心5min，弃上清，沉淀的粪泥作接种用。
分离培养 吸取处理后的粪样接种至配好的营养琼脂双向培养基，每管100uL，于37℃恒温培养箱培养，后每24h取培养液进行一次形态学观察。出现大量的成熟期四核包囊后，取100uL培养液接种于新的培养基中促进包囊破解为滋养体及滋养体的繁殖。
形态观察 每24h用光学显微镜观察一次包囊的形态变化并记录。
2 结果与分析
2.1 粪便中阿米巴包囊及囊后滋养体
粪样直接镜检可见未成熟的溶组织内阿米巴包囊、成熟的溶组织内阿米巴包囊、成熟的结肠内阿米巴包囊以及由于染色质量不高而分辨不出的包囊和囊后滋养体。
后经实验室分子鉴定，该疑似溶组织内阿米巴为迪斯帕内阿米巴。
2.1.1 未成熟的迪斯帕内阿米巴包囊 所见的未成熟包囊多为单核包囊，圆球形，直径为15μm左右，有囊壁，一个核，拟染色体和糖原泡染色不明显（图一）。
2.1.2 成熟的迪斯帕内阿米巴包囊 该时期为感染期包囊，无拟染色体和糖原泡，有四个泡状核，包囊呈淡棕色，直径13μm左右，内外质分解明显（图2）。
图1 单核阿米巴包囊（40×10） 图2 四核阿米巴包囊（40×10）
2.1.3 成熟的结肠内阿米巴包囊 包囊较大，1020μm，圆球形，染色较浅，可见近8个细胞核，未见到糖原体和拟染色体，可见核仁，内外质分解明显。核周染色质粒分布不均，核仁大，多偏位（图3）。
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摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
1.1 材料 2
1.1.1 主要仪器设备 2
1.1.2 粪样采集 2
1.1.3 培养基配制 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 粪样处理 2
1.2.2 分离培养 2
1.2.3 形态观察 2
2 结果与分析 2
2.1 粪便中阿米巴包囊及囊后滋养体 2
2.1.1 未成熟的迪斯帕内阿米巴包囊 2
2.1.2 成熟的迪斯帕内阿米巴包囊 3
2.1.3 成熟的结肠内阿米巴包囊 3
2.1.4 其他囊后滋养体与包囊 4
2.2 培养基中阿米巴包囊 4
2.3 培养基中阿米巴滋养体 4
3 讨论 5
3.1形态学讨论 5
3.2 结肠内阿米巴与迪斯帕内阿米巴活力强弱讨论 6
3.3 虫体体外培养讨论 6
致谢 6
参考文献 6
黑猩猩肠道内阿米巴原虫的分离培养及形态观察
引言
阿米巴原虫属肉足鞭毛门(Sarcomastiug ophora)。叶足纲(Lobosasida)、阿米巴目(Amoebida)。由于生活环境不同可分为内阿米巴和自由生活阿米巴, 前者寄生于人和动物, 主要有4个属, 内阿米巴属(Entamoeba)、内蜒属(Endolimax )、嗜碘 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
阿米巴属(Iodamoeba) 和脆双核阿米巴属(Dientamoeba)；后者生活在水和泥土中，偶尔侵入动物机体，主要有5个属，即耐格里属(Naegleria)、棘阿米巴属(Acanthamoeba)、哈曼属(Hartmannella)、Vablkampfia 属和Sappinia属[2]。
现已知内阿米巴属的溶组织内阿米巴会引发阿米巴痢疾和肝脓肿，耐格里属和棘阿米巴属主要引起脑膜脑炎、角膜炎、口腔感染和皮肤损伤等。临床上,，溶组织内阿米巴引发的病例多，感染面广，危害大。因此，不同种肠道阿米巴的形态观察及鉴别在临床诊断上有着重要意义。
溶组织内阿米巴生活周期中有两个主要时期，即滋养体时期和包囊期。滋养体时期是摄食、活动和增殖的生活时期。滋养体可借助伪足的机械运动和水解酶作用入侵肠壁组织，或经血液循环移至肝脏和其他器官，吞噬红细胞和组织细胞，破坏和溶解组织，并在组织内增殖形成包囊，然后将包囊经粪便排出体外。包囊期是具有保护性外壁的生活阶段，多在宿主粪便和分泌物中找到，无致病性，当其发育成四核包囊时，就成为感染性包囊，被宿主吞食后，会在组织中继续发育形成滋养体。其生活史归结起来就是“包囊滋养体包囊”的循环过程[23]。
迪斯帕内阿米巴与溶组织内阿米巴(Entamoeba histolytica)形态相似、生活史相同，从形态上无法鉴定，常误诊。结肠内阿米巴直径略大于溶组织内阿米巴，在我国与其平行分布，发现时有必要继续寻找后者。对动物园圈养黑猩猩粪便镜检发现阿米巴原虫包囊，用药后病愈。现采集该黑猩猩慢性感染期粪便进行形态学鉴定，发现该黑猩猩为结肠内阿米巴和迪斯帕内阿米巴混合感染。经分离培养，培养成迪斯帕内阿米巴滋养体，并对其进行形态观察，为日后镜检鉴定提供依据，并为其分子学鉴定提供虫体原料。
1 材料与方法
材料
主要仪器设备 显微镜，生物安全柜，260目筛，离心机，冰箱，恒温培养箱等。
粪样采集 粪样取自动物园猩猩馆圈养的黑猩猩。取黑猩猩新鲜粪便50g左右于小烧杯中待处理。
培养基配制 本实验采用经杨光友等人改良后的营养琼脂双相培养基。在1000mL蒸馏水中加入8gNaCl，0.2gKCl，0.2gCaCl2，0.01gMgCl2，2gNa2HPO4，KH2HPO4。CaCl2和MgCl2分装于不同的容器其他液体部分同装一个容器，高温灭菌，冷却，混匀，取500mL加入1.5g牛肉浸膏，2.5g蛋白胨，7.5g琼脂。沸水浴2~3h，完全溶解，残渣可用四层纱布过滤除去，并趁热将滤液用试管分装，每管5mL，高温灭菌，放成斜面，备用。剩余500mL液体保留。接种前，每管加B部分液体4.5mL和猴子血清0.5mL，灭菌米粉20mg，青霉素1000单位，链霉素2000单位[4]。
实验方法
粪样处理 向载玻片中央滴一滴碘液，用牙签沾取少许粪样混于碘液中，混匀后加以盖玻片，等待5min后于显微镜下直接镜检，观察是否有碘染的阿米巴包囊，拍照，观察形态，测量大小，做初步鉴定。向盛有粪便的小烧杯中加入适量蒸馏水，搅拌至混合溶解均匀，结合260目筛及漏斗过滤。将滤液于离心机中3000r/min离心5min，弃上清，沉淀的粪泥作接种用。
分离培养 吸取处理后的粪样接种至配好的营养琼脂双向培养基，每管100uL，于37℃恒温培养箱培养，后每24h取培养液进行一次形态学观察。出现大量的成熟期四核包囊后，取100uL培养液接种于新的培养基中促进包囊破解为滋养体及滋养体的繁殖。
形态观察 每24h用光学显微镜观察一次包囊的形态变化并记录。
2 结果与分析
2.1 粪便中阿米巴包囊及囊后滋养体
粪样直接镜检可见未成熟的溶组织内阿米巴包囊、成熟的溶组织内阿米巴包囊、成熟的结肠内阿米巴包囊以及由于染色质量不高而分辨不出的包囊和囊后滋养体。
后经实验室分子鉴定，该疑似溶组织内阿米巴为迪斯帕内阿米巴。
2.1.1 未成熟的迪斯帕内阿米巴包囊 所见的未成熟包囊多为单核包囊，圆球形，直径为15μm左右，有囊壁，一个核，拟染色体和糖原泡染色不明显（图一）。
2.1.2 成熟的迪斯帕内阿米巴包囊 该时期为感染期包囊，无拟染色体和糖原泡，有四个泡状核，包囊呈淡棕色，直径13μm左右，内外质分解明显（图2）。
图1 单核阿米巴包囊（40×10） 图2 四核阿米巴包囊（40×10）
2.1.3 成熟的结肠内阿米巴包囊 包囊较大，1020μm，圆球形，染色较浅，可见近8个细胞核，未见到糖原体和拟染色体，可见核仁，内外质分解明显。核周染色质粒分布不均，核仁大，多偏位（图3）。
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