hdac8在小鼠卵母细胞减数分裂中的作用及其机制的研究
HDAC8作为组蛋白家族Ⅰ的一种去乙酰化酶，它广泛地存在于细胞质中，由非组蛋白底物的介导而参与诸多的生理和病理过程；然而，其在卵母细胞减数分裂中的作用尚不明确。在本研究中，免疫荧光的分析表明HDAC8在卵母细胞减数分裂中定位于纺锤体两极，并参与微管组装的调控。RNAi对HDAC8的敲低导致了MⅠ期卵母细胞纺锤体形态的畸变以及动粒-微管结合的破坏，并引起染色体排列的紊乱和非整倍体的产生。同时，HDAC8特异性的抑制剂PCI-34051对卵母细胞的抑制处理也引起了相似的纺锤体/染色体异常的发生。此外，HDAC8对于γ-tubulin在纺锤体的定位也不可或缺。上述结果表明HDAC8在卵母细胞减数分裂中密切调控着纺锤体的组装以及染色体的分离，从而确保正常整倍体的产生。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言2
1材料与方法2
1.1实验动物2
1.2实验抗体2
1.3 卵母细胞采集与培养3
1.4 HDAC8的抑制3
1.5 siRNA显微注射3
1.6 免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测3
1.7 Western Blotting4
1.8 染色体铺片5
1.9 数据统计与分析5
2 结果与分析5
2.1 HDAC8定位于小鼠卵母细胞纺锤体两极 5
2.2 HDAC8的敲低导致卵母细胞纺锤体形态及染色体排列的异常 6
2.3 HDAC8的敲低导致卵母细胞动粒微管结构的破坏与非整倍体的产生 8
2.4 HDAC8活性的抑制引起卵母细胞纺锤体形态及染色体排列的异常 9
2.5 HDAC8的敲低引起小鼠卵母细胞γtubulin定位的紊乱 10
3 讨论 12
致谢 13
参考文献 13
附录A 英文缩略词15
附录B 相关学术论文的发表16
HDAC8在小鼠卵母细胞减数分裂中的作用
及其机制的研究
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
在哺乳动物中，卵母细胞经过两次减数分裂使染色体数目减半。同源染色体的分离发生于第一次减数分裂，而姐妹染色单体则在第二次减数分裂分离至两个子细胞中[1]。卵母细胞的两次减数分裂过程受到精细的调控，以保证成熟分裂的正常进行和遗传物质的分配；减数分裂的异常，如纺锤体形态的畸变，很可能导致非整倍体的产生[2,3]。而且，两次减数分裂的异常还存在着一定的相关性和促发性[4]。子代染色体数量的异常（增多或减少）往往和遗传疾病以及癌症的发生息息相关[5,6]。因此，减数分裂的调控对于正常后代的产生显得尤为重要。
组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是一类可水解组蛋白赖氨酸乙酰基的蛋白酶，组蛋白的去乙酰化可促进其与DNA的结合而导致染色质凝缩，以抑制DNA的转录[7,8]。长期以来，人们认为HDACs仅仅作用于细胞核的组蛋白，但越来越多的研究表明HDACs还参与了其它的生理及病理活动，比如肿瘤、神经退行性疾病以及机体代谢的调控[911]。
目前已鉴定出了18种HDACs，并根据其蛋白序列及结构域的差异而分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四个家族[12]，HDAC8归属于家族Ⅰ[13]。HDAC8作为一种广泛分布于细胞质的去乙酰化酶，它可作用于多种非组蛋白底物，参与不同生理活动的调节。以往的研究表明，HDAC8可共定位并结合平滑肌动蛋白（αSMA），从而调节平滑肌的收缩[1416]。在卵母细胞减数分裂中，HDAC8还参与了SMC3乙酰化水平的调节，并调控cohesin复合体的功能以及姐妹染色单体的正常分离[17]。HDAC8的敲低可抑制结肠和子宫颈癌细胞的分化[9]，而HDAC8的上调则促进肝癌细胞的增殖[18]。此外，HDAC8还作用于中心体的聚合并介导病原微生物对宿主的感染[19]。
本研究旨在揭示HDAC8在小鼠卵母细胞减数分裂中的潜在作用。试验结果表明HDAC8主要分布在卵母细胞纺锤体两极，并调控γtubulin的定位，还作用于纺锤体的组装和染色体排列，从而确保正常整倍体的产生。
1 材料与方法
1.1 实验动物
实验使用健康的ICR雌鼠（46周龄），并按照大学实验动物饲养与使用的相关规定将其短期饲养于实验动物房。
1.2 实验抗体
名称
来源
兔源antiHDAC8抗体
Abcam（Cambridge, MA, USA）
鼠源antiαtubulinFITC抗体
Sigma（St. Louis, MO, USA）
鼠源antiacetylαtubulin抗体
Sigma（St. Louis, MO, USA）
鼠源antiγtubulin抗体
Sigma（St. Louis, MO, USA）
人源anticentromere抗体
Antibodies Incorporated（Davis, CA, USA）
FITC标记山羊抗兔 IgG (H + L)
中杉金桥生物技术公司（中国，北京）
TRITC标记山羊抗兔IgG (H + L)
中杉金桥生物技术公司（中国，北京）
FITC标记山羊抗鼠IgG (H + L)
中杉金桥生物技术公司（中国，北京）
1.3 卵母细胞采集与培养
1.3.1 卵母细胞采集 将46周龄ICR雌鼠以脊椎脱臼处死，通过外科手术取出其两侧卵巢，并放于事先在培养箱预热的M2培养滴中。在培养皿中用切剖法分离卵母细胞与卵巢组织，然后向其中加入预热的M2培养液，在解剖显微镜下捡出所需的GV期卵母细胞。
1.3.2 卵母细胞体外培养 将GV期卵母细胞移至M2培养滴中清洗其附带杂质，然后移至预热的M16培养滴，并用石蜡油密封培养滴，再放于5%CO2、95%湿度及37℃恒温培养箱中培养至MⅠ或MⅡ期。
1.4 HDAC8的抑制处理
将HDAC8抑制剂PCI34051以1:1000的配比稀释于M2及M16培养滴中，然后将此培养滴用于卵母细胞的培养。对照组培养滴不添加抑制剂。
1.5 siRNA显微注射
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words 1
引言2
1材料与方法2
1.1实验动物2
1.2实验抗体2
1.3 卵母细胞采集与培养3
1.4 HDAC8的抑制3
1.5 siRNA显微注射3
1.6 免疫荧光与激光共聚焦显微镜检测3
1.7 Western Blotting4
1.8 染色体铺片5
1.9 数据统计与分析5
2 结果与分析5
2.1 HDAC8定位于小鼠卵母细胞纺锤体两极 5
2.2 HDAC8的敲低导致卵母细胞纺锤体形态及染色体排列的异常 6
2.3 HDAC8的敲低导致卵母细胞动粒微管结构的破坏与非整倍体的产生 8
2.4 HDAC8活性的抑制引起卵母细胞纺锤体形态及染色体排列的异常 9
2.5 HDAC8的敲低引起小鼠卵母细胞γtubulin定位的紊乱 10
3 讨论 12
致谢 13
参考文献 13
附录A 英文缩略词15
附录B 相关学术论文的发表16
HDAC8在小鼠卵母细胞减数分裂中的作用
及其机制的研究
引言
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
在哺乳动物中，卵母细胞经过两次减数分裂使染色体数目减半。同源染色体的分离发生于第一次减数分裂，而姐妹染色单体则在第二次减数分裂分离至两个子细胞中[1]。卵母细胞的两次减数分裂过程受到精细的调控，以保证成熟分裂的正常进行和遗传物质的分配；减数分裂的异常，如纺锤体形态的畸变，很可能导致非整倍体的产生[2,3]。而且，两次减数分裂的异常还存在着一定的相关性和促发性[4]。子代染色体数量的异常（增多或减少）往往和遗传疾病以及癌症的发生息息相关[5,6]。因此，减数分裂的调控对于正常后代的产生显得尤为重要。
组蛋白去乙酰化酶（HDACs）是一类可水解组蛋白赖氨酸乙酰基的蛋白酶，组蛋白的去乙酰化可促进其与DNA的结合而导致染色质凝缩，以抑制DNA的转录[7,8]。长期以来，人们认为HDACs仅仅作用于细胞核的组蛋白，但越来越多的研究表明HDACs还参与了其它的生理及病理活动，比如肿瘤、神经退行性疾病以及机体代谢的调控[911]。
目前已鉴定出了18种HDACs，并根据其蛋白序列及结构域的差异而分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ四个家族[12]，HDAC8归属于家族Ⅰ[13]。HDAC8作为一种广泛分布于细胞质的去乙酰化酶，它可作用于多种非组蛋白底物，参与不同生理活动的调节。以往的研究表明，HDAC8可共定位并结合平滑肌动蛋白（αSMA），从而调节平滑肌的收缩[1416]。在卵母细胞减数分裂中，HDAC8还参与了SMC3乙酰化水平的调节，并调控cohesin复合体的功能以及姐妹染色单体的正常分离[17]。HDAC8的敲低可抑制结肠和子宫颈癌细胞的分化[9]，而HDAC8的上调则促进肝癌细胞的增殖[18]。此外，HDAC8还作用于中心体的聚合并介导病原微生物对宿主的感染[19]。
本研究旨在揭示HDAC8在小鼠卵母细胞减数分裂中的潜在作用。试验结果表明HDAC8主要分布在卵母细胞纺锤体两极，并调控γtubulin的定位，还作用于纺锤体的组装和染色体排列，从而确保正常整倍体的产生。
1 材料与方法
1.1 实验动物
实验使用健康的ICR雌鼠（46周龄），并按照大学实验动物饲养与使用的相关规定将其短期饲养于实验动物房。
1.2 实验抗体
名称
来源
兔源antiHDAC8抗体
Abcam（Cambridge, MA, USA）
鼠源antiαtubulinFITC抗体
Sigma（St. Louis, MO, USA）
鼠源antiacetylαtubulin抗体
Sigma（St. Louis, MO, USA）
鼠源antiγtubulin抗体
Sigma（St. Louis, MO, USA）
人源anticentromere抗体
Antibodies Incorporated（Davis, CA, USA）
FITC标记山羊抗兔 IgG (H + L)
中杉金桥生物技术公司（中国，北京）
TRITC标记山羊抗兔IgG (H + L)
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FITC标记山羊抗鼠IgG (H + L)
中杉金桥生物技术公司（中国，北京）
1.3 卵母细胞采集与培养
1.3.1 卵母细胞采集 将46周龄ICR雌鼠以脊椎脱臼处死，通过外科手术取出其两侧卵巢，并放于事先在培养箱预热的M2培养滴中。在培养皿中用切剖法分离卵母细胞与卵巢组织，然后向其中加入预热的M2培养液，在解剖显微镜下捡出所需的GV期卵母细胞。
1.3.2 卵母细胞体外培养 将GV期卵母细胞移至M2培养滴中清洗其附带杂质，然后移至预热的M16培养滴，并用石蜡油密封培养滴，再放于5%CO2、95%湿度及37℃恒温培养箱中培养至MⅠ或MⅡ期。
1.4 HDAC8的抑制处理
将HDAC8抑制剂PCI34051以1:1000的配比稀释于M2及M16培养滴中，然后将此培养滴用于卵母细胞的培养。对照组培养滴不添加抑制剂。
1.5 siRNA显微注射
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