免疫增强在山豆根多糖及其硫酸酯治疗鸭病毒性肝炎中的作用
：山豆根多糖（BSRPS）及其硫酸化产物山豆根多糖硫酸酯（sBSRPS），具有抗鸭肝炎病毒（DHAV）活性的作用。然而，它们的抗病毒机制仍然不明确。本文研究了免疫增强在BSRPS和sBSRPS治疗鸭病毒性肝炎（DVH）中的作用。首先通过MTT法测定两者刺激淋巴细胞增殖的效果，然后，用DHAV对雏鸭进行攻毒，并用BSRPS和sBSRPS进行治疗。用酶联免疫吸附法测定总抗体（Ab）、干扰素γ（IFN-γ）、肝细胞生长因子（HGF）、白介素（IL）-2、IL-6和IL-8等细胞因子。结果表明，BSRPS可以稳定HGF的含量，达到了很好的保肝作用。与BSRPS组相比，硫酸化修饰物sBSRPS能够提升B和T淋巴细胞的增殖率，促进总抗体、IFN-γ和IL-2的分泌。综上所述，两者在治疗鸭病毒性肝炎（DVH）中均表现出免疫增强作用，sBSRPS比BSRPS更有效。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words...1
引言.2
1 材料与方法..2
1.1 试剂和病毒.2
1.2 BSRPS和sBSRPS....3
1.3 动物3
1.4 细胞...3
1.4.1 DEHs.3
1.4.2 脾B淋巴细胞4
1.4.3 外周血T淋巴细胞4
1.5 体外试验. 4
1.5.1 BSRPS和sBSRPS对DHAV毒力的影响. 4
1.5.2 脾B淋巴细胞增殖试验 4
1.5.3 外周血T淋巴细胞增殖实验 4
1.6 体内实验 4
1.6.1 动物分组及治疗 4
1.6.2 血液中的DHAV的定量分析 5
1.6.3 总抗体和细胞因子的测定 4
1.7 统计分析 5
2 结果.5
2.1 药物处理后DHAV的毒力.5
2.2 对淋巴细胞增殖的影响.5
2.2.1 B淋巴细胞.5
2.2.2 T淋巴细胞.5
2.3 体内病毒的抑制作用..5
2.4 总抗体的含量及
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
血清细胞因子..7
3 讨论.8
4 结论10
致谢10
参考文献10
免疫增强在山豆根多糖及其硫酸酯治疗鸭病毒性肝炎中的作用
引言
多糖广泛分布于自然环境中，由10个及以上的单糖组成。对生物多糖的最早的研究可追溯到约20世纪30年代对细菌多糖抗肿瘤活性的研究[1]。近年来，有报道认为从中国传统中草药提取的多种多糖具有抗病毒[2]和免疫增强[3]方面发挥了作用。同时其硫酸化修饰常被用来改善这类抗病毒[4]和免疫增强[5]的活性。如今，生物多糖因为其高生物活性和低毒性，已在临床上得到广泛应用。
免疫增强是个体抵抗病毒性疾病的重要途径。B细胞分泌的抗体（Ab）能中和病毒。由辅助性T（TH）或自然杀伤（NK）细胞产生的γ干扰素（IFNγ）可以通过免疫增强作用间接清除病毒。据报道，辅助细胞是NK细胞生产IFNγ以及丙型肝炎病毒感染中免疫调节的关键[6]。白细胞介素（IL）2和其他细胞因子也与病毒清除密切相关[7,8]。
据报道山豆根多糖（BSRPS）在体外浓度为50，100，200或400mg/升浓度时可以刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖[9]。高效液相色谱法和气相色谱仪的分析表示BSRPS仅由D葡萄糖构成。其分子量为2.24×104，旋光度为[α]20D = +68°(C0.75, H2O)。通过过氯酸氧化，Smith降解，甲基化分析，红外光谱测定法，1H和13C NMR分析，结果表明，山豆根多糖的化学结构是D葡萄糖残基以α(1→4)连接为主链，在3O及6O位有分枝，每12个葡萄糖残基为一个重复单元的葡聚糖。BSRPS结构式如图1 [9]。
图1. BSRPS结构式
山豆根多糖硫酸酯（sBSRPS）是BSRPS的硫酸化产物，在体外具有抑制肝炎病毒的作用[10]。红外光谱测定表明sBSRPS比BSRPS多了两个新的吸收峰，分别表现在1248cm1和814cm1（sBSRPS）。这两个特定的吸收峰分别代表的S=O不对称伸缩振动和COS对称伸缩振动。证明了硫酸基团已被添加入BSRPS[11]。
我们课题组之前研究过BSRPS和sBSPRS的抗DHAV能力以及其在体外抗病毒机制[11]，其结果表明：其抗病毒机制与抑制病毒的复制和释放有关，并且，sBSRPS的抗病毒能力比BSRPS强。之后我们研究了在治疗由DHAV感染引起的鸭病毒肝炎（DVH）过程中两者抗氧化能力[12]，结果表明在治疗过程中，BSRPS和sBSRPS的抗氧化起到了重要的作用。两者的抗氧化能力相似，但sBSRPS的抗DVH能力较好。为了详细研究BSRPS和sBSRPS抗DVH机制及其差异，本文着重于探索其免疫学机制。
到目前为止，BSRPS及其硫酸酯在抗病毒过程中的免疫调节作用仍未被研究。因此本研究的目的是分析免疫增强在BSRPS和sBSRPS抗DHAV中的作用。BSRPS由氯磺酸吡啶方法进行修饰。同时测定两者对B和T淋巴细胞增殖率的影响，并实时监测DHAV含量、鸭DHAV总抗体、IFNγ、肝细胞生长因子（HGF）、IL2、IL6及IL8的水平，以评价免疫调节对BSRPS和sBSRPS治疗DVH作用的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂和病毒
含有青霉素100 IU /mL、链霉素100 IU/mL、谷氨酰胺0.75mg/mL和10％胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle培养基（DMEM）（Gibco）由，用于培养鸭胚肝细胞（DEHs）。含有青霉素100IU/mL、链霉素100 IU/mL、谷氨酰胺0.75mg/mL和1％胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle培养基（DMEM）（Gibco），作为维持培养基（MM）用于稀释BSRPS和sBSRPS，或维持DEHs。用含有青霉素100IU /mL、链霉素100 IU/mL和10％胎牛血清的RPMI1640（Gibco）稀释BSRPS和sBSRPS，或重新悬浮淋巴细胞和培养淋巴细胞。Dulbecco’Hanks平衡盐溶液（DHank’s）用于洗涤胚胎组织碎片、DEHs和淋巴细胞。DHank’s，DMEM，MM和RPMI1640的pH值通过用5.6％碳酸氢钠溶液调节至7.4。作为T细胞有丝分裂原的植物血凝素（PHA，Sigma公司），以及作为B细胞有丝分裂原的脂多糖（LPS，Sigma公司），分别用RPMI1640溶解为100μg/mL的溶液。这些试剂均用0.22μm注射过滤器过滤。DMEM，MM，RPMI1640和DHank’s储存在4℃；MTT溶液在4℃条件下避光保存。PHA和LPS贮存在20℃。
吡啶（批号20130220）和N,N二甲基甲酰胺（批号20130202）为国药集团化学公司的产品。氯磺酸（批号130622）为上海凌峰化学公司的产品。淋巴细胞分离介质（G20111118）为天津灏洋生物制造公司的产品。肝素钠用生理盐水溶解成2mg/mL溶液。
RNAiso加试剂（批号9182），PrimeScriptTM RT Master试剂盒（批号AK4202）和SYBR? TaqTM（Tli RNA酶H Plus）试剂盒（批号AK3802）为Takara的产品。在实验中使用的均为分析纯。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words...1
引言.2
1 材料与方法..2
1.1 试剂和病毒.2
1.2 BSRPS和sBSRPS....3
1.3 动物3
1.4 细胞...3
1.4.1 DEHs.3
1.4.2 脾B淋巴细胞4
1.4.3 外周血T淋巴细胞4
1.5 体外试验. 4
1.5.1 BSRPS和sBSRPS对DHAV毒力的影响. 4
1.5.2 脾B淋巴细胞增殖试验 4
1.5.3 外周血T淋巴细胞增殖实验 4
1.6 体内实验 4
1.6.1 动物分组及治疗 4
1.6.2 血液中的DHAV的定量分析 5
1.6.3 总抗体和细胞因子的测定 4
1.7 统计分析 5
2 结果.5
2.1 药物处理后DHAV的毒力.5
2.2 对淋巴细胞增殖的影响.5
2.2.1 B淋巴细胞.5
2.2.2 T淋巴细胞.5
2.3 体内病毒的抑制作用..5
2.4 总抗体的含量及
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
血清细胞因子..7
3 讨论.8
4 结论10
致谢10
参考文献10
免疫增强在山豆根多糖及其硫酸酯治疗鸭病毒性肝炎中的作用
引言
多糖广泛分布于自然环境中，由10个及以上的单糖组成。对生物多糖的最早的研究可追溯到约20世纪30年代对细菌多糖抗肿瘤活性的研究[1]。近年来，有报道认为从中国传统中草药提取的多种多糖具有抗病毒[2]和免疫增强[3]方面发挥了作用。同时其硫酸化修饰常被用来改善这类抗病毒[4]和免疫增强[5]的活性。如今，生物多糖因为其高生物活性和低毒性，已在临床上得到广泛应用。
免疫增强是个体抵抗病毒性疾病的重要途径。B细胞分泌的抗体（Ab）能中和病毒。由辅助性T（TH）或自然杀伤（NK）细胞产生的γ干扰素（IFNγ）可以通过免疫增强作用间接清除病毒。据报道，辅助细胞是NK细胞生产IFNγ以及丙型肝炎病毒感染中免疫调节的关键[6]。白细胞介素（IL）2和其他细胞因子也与病毒清除密切相关[7,8]。
据报道山豆根多糖（BSRPS）在体外浓度为50，100，200或400mg/升浓度时可以刺激小鼠脾淋巴细胞的增殖[9]。高效液相色谱法和气相色谱仪的分析表示BSRPS仅由D葡萄糖构成。其分子量为2.24×104，旋光度为[α]20D = +68°(C0.75, H2O)。通过过氯酸氧化，Smith降解，甲基化分析，红外光谱测定法，1H和13C NMR分析，结果表明，山豆根多糖的化学结构是D葡萄糖残基以α(1→4)连接为主链，在3O及6O位有分枝，每12个葡萄糖残基为一个重复单元的葡聚糖。BSRPS结构式如图1 [9]。
图1. BSRPS结构式
山豆根多糖硫酸酯（sBSRPS）是BSRPS的硫酸化产物，在体外具有抑制肝炎病毒的作用[10]。红外光谱测定表明sBSRPS比BSRPS多了两个新的吸收峰，分别表现在1248cm1和814cm1（sBSRPS）。这两个特定的吸收峰分别代表的S=O不对称伸缩振动和COS对称伸缩振动。证明了硫酸基团已被添加入BSRPS[11]。
我们课题组之前研究过BSRPS和sBSPRS的抗DHAV能力以及其在体外抗病毒机制[11]，其结果表明：其抗病毒机制与抑制病毒的复制和释放有关，并且，sBSRPS的抗病毒能力比BSRPS强。之后我们研究了在治疗由DHAV感染引起的鸭病毒肝炎（DVH）过程中两者抗氧化能力[12]，结果表明在治疗过程中，BSRPS和sBSRPS的抗氧化起到了重要的作用。两者的抗氧化能力相似，但sBSRPS的抗DVH能力较好。为了详细研究BSRPS和sBSRPS抗DVH机制及其差异，本文着重于探索其免疫学机制。
到目前为止，BSRPS及其硫酸酯在抗病毒过程中的免疫调节作用仍未被研究。因此本研究的目的是分析免疫增强在BSRPS和sBSRPS抗DHAV中的作用。BSRPS由氯磺酸吡啶方法进行修饰。同时测定两者对B和T淋巴细胞增殖率的影响，并实时监测DHAV含量、鸭DHAV总抗体、IFNγ、肝细胞生长因子（HGF）、IL2、IL6及IL8的水平，以评价免疫调节对BSRPS和sBSRPS治疗DVH作用的影响。
1 材料与方法
1.1 试剂和病毒
含有青霉素100 IU /mL、链霉素100 IU/mL、谷氨酰胺0.75mg/mL和10％胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle培养基（DMEM）（Gibco）由，用于培养鸭胚肝细胞（DEHs）。含有青霉素100IU/mL、链霉素100 IU/mL、谷氨酰胺0.75mg/mL和1％胎牛血清的Dulbecco’s Modified Eagle培养基（DMEM）（Gibco），作为维持培养基（MM）用于稀释BSRPS和sBSRPS，或维持DEHs。用含有青霉素100IU /mL、链霉素100 IU/mL和10％胎牛血清的RPMI1640（Gibco）稀释BSRPS和sBSRPS，或重新悬浮淋巴细胞和培养淋巴细胞。Dulbecco’Hanks平衡盐溶液（DHank’s）用于洗涤胚胎组织碎片、DEHs和淋巴细胞。DHank’s，DMEM，MM和RPMI1640的pH值通过用5.6％碳酸氢钠溶液调节至7.4。作为T细胞有丝分裂原的植物血凝素（PHA，Sigma公司），以及作为B细胞有丝分裂原的脂多糖（LPS，Sigma公司），分别用RPMI1640溶解为100μg/mL的溶液。这些试剂均用0.22μm注射过滤器过滤。DMEM，MM，RPMI1640和DHank’s储存在4℃；MTT溶液在4℃条件下避光保存。PHA和LPS贮存在20℃。
吡啶（批号20130220）和N,N二甲基甲酰胺（批号20130202）为国药集团化学公司的产品。氯磺酸（批号130622）为上海凌峰化学公司的产品。淋巴细胞分离介质（G20111118）为天津灏洋生物制造公司的产品。肝素钠用生理盐水溶解成2mg/mL溶液。
RNAiso加试剂（批号9182），PrimeScriptTM RT Master试剂盒（批号AK4202）和SYBR? TaqTM（Tli RNA酶H Plus）试剂盒（批号AK3802）为Takara的产品。在实验中使用的均为分析纯。
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