及周边地区猪德尔塔冠状病毒s基因的撒全长序列测定及进化分析
猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus, PDCoV）于2012年在中国香港首次发现，并于2014年2月在美国报告,现已传播到中国大陆，韩国，泰国和老挝。与其他冠状病毒一样，PDCoV通常含有4种主要 结构蛋白纤突（S），包膜（E），膜（M）和核衣壳蛋白（N）。本研究通过RT-PCR的方法，对PDCoV检测阳性的病料进行病毒S全基因扩增并测序，将获得的S基因序列与56个分离自不同时间、不同国家的PDCoV S基因的序列和15个其他冠状病毒亚科病毒的S基因序列进行比较并做进化树分析。结果显示本研究共扩增出11个不同的S基因序列，有2株病毒的S基因长度是3483nt，其他9株病毒的S基因长度为3480nt；系统进化树结果分析表明有3株病毒的S基因与东南亚地区病毒的S基因亲缘关系最近，其他8株病毒的S基因与中国本土的S基因序列相似。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 病料与核酸 2
1.1.2 主要试剂与缓冲液配方 2
1.1.3 主要仪器 2
1.1.4分子生物学分析软件 2
1.2 方法 3
1.2.1 病毒基因组反转录 3
1.2.2 病毒S基因扩增 3
1.2.3 S基因测序 3
1.2.4 S基因核苷酸序列分析 4
2 结果 4
2.1 病毒S基因的扩增 4
2.2 S基因核苷酸同源性比较 6
2.3 S基因编码氨基酸同源性比较 6
2.4 S基因序列比较和系统发育分析 6
3 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
江苏及周边地区猪德尔塔冠状病毒S基因的
全长序列测定及进化分析
引言
2012年，猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus, PDCoV）在中国香港的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
一次对哺乳动物和鸟类的冠状病毒的研究中首次被发现[1]。2014年2月，在美国猪群中检测出PDCoV，并迅速扩散到美国的多个州[2]，现已传播到中国，韩国，泰国和老挝[35]。在国内，从2014年开始，研究人员在我国江苏、安徽、湖北、黑龙江、江西、四川、山西等地的猪场粪样中均检测到 PDCoV病毒。虽然该病毒在国内还大面积扩散，但从其在美国的流行趋势及我国报到情况来看，预计该病近年内将会在我国全面发生[6]。
与PEDV和TGEV类似,PDCoV可导致细胞溶解，并且受感染的肠细胞会发生急性坏死，导致小肠中的绒毛明显萎缩，而大肠中的变化并不明显[710]。同时PDCoV可能不会诱导受感染猪小肠中的肠上皮细胞的凋亡。PDCoV抗原和核酸主要分布于小肠（十二指肠到回肠）和大肠的绒毛状肠细胞中，而在其他器官如胃，肺，心脏，扁桃体，脾脏，肝脏和肾脏中则未检测到PDCoV抗原[710]。实验攻毒的无菌猪的临床症状与PEDV和TGEV相似，此外，PDCoV还诱导急性、水样腹泻，常伴有急性轻度至中度呕吐，最终导致脱水，体重减轻，嗜睡和死亡[10, 11]。在受感染的哺乳猪中，临床正常也与PEDV和TGEV相似，大体病变局限于胃肠道，其特征为肠壁薄（空肠到结肠近端）薄而透明，肠腔内积聚大量黄色液体[710]。肚子中充满凝乳，与PEDV感染相比，肠的透明度和脆性变化似乎更轻。与PEDV和TGEV一样，PDCoV诱发的腹泻可能是由于吸收性肠细胞大量丧失进而导致的吸收不良性腹泻，肠细胞的功能障碍也可能导致吸收不良性腹泻。与PEDV相似[12]，结肠上皮细胞中的轻度空泡可能会干扰水和电解质的重要的重吸收[13]。由于肠道细胞的大量损失，在腹泻小猪的小肠中，刷状缘膜结合的消化酶例如二糖酶（乳糖酶，蔗糖酶和麦芽糖酶），亮氨酸APN和碱性磷酸酶的表达量显著降低[14]，导致消化不良性腹泻。呕吐加剧了脱水，但PDCoV诱发呕吐的机制尚不清楚。
PDCoV S基因编码的蛋白为病毒纤突蛋白，是PDCoV的主要结构蛋白，具有较高变异性[13]，常被用于病毒遗传变异分析。本课题对从江苏周边地区送检的PDCoV阳性临床病料进行S基因的全长测序及序列分析，通过对S基因进行进化树分析及氨基酸位点分析 研究PDCoV 的进化情况及抗原变异程度，为PDCoV的有效防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料与核酸
送检病料来自于江苏周边地区（安徽、湖北、广西等地）的发病猪场，核酸由大学免疫研究所实验室提取并保存。
1.1.2 主要试剂与缓冲液配方
反转录试剂盒购自Thermo公司；premix Taq，DNA Marker DL 5000购自TakaRa公司；Gel Green购自Biotium公司；琼脂糖购自Biowest公司；10×TAE缓冲液：依次将24.2 g Tris 碱, 5.71 ml 冰醋酸, 10 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)加入400 ml超纯水中, 最后定容至500 ml；1%琼脂糖凝胶：5ml 10×TAE、45ml ddH?O、琼脂糖0.5g，加热溶解。
1.1.3 主要仪器
凝胶成像系统（BioRad公司），低温冰箱（20℃）（Haier公司）、低温冰箱（80℃）（SANYO公司）、制冰机（SANYO公司)、生物安全柜（LABCONCO公司）、微量电子天平（METTERAE260型，Deltalange公司）、去离子净水系统（Milipore公司）、PCR仪（Eppendorf AG 22331 Hamburg，德国制造）、超净工作台（Forma Scientific型，上海博逊实业有限公司）、电泳仪及电泳槽（北京六一仪器）、厂恒温水浴箱（DK80型，上海一恒科技有限公司），微波炉（格兰仕）、离心机（Beckman Coulter公司）
1.1.4分子生物学分析软件
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract. 1
Key words 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 病料与核酸 2
1.1.2 主要试剂与缓冲液配方 2
1.1.3 主要仪器 2
1.1.4分子生物学分析软件 2
1.2 方法 3
1.2.1 病毒基因组反转录 3
1.2.2 病毒S基因扩增 3
1.2.3 S基因测序 3
1.2.4 S基因核苷酸序列分析 4
2 结果 4
2.1 病毒S基因的扩增 4
2.2 S基因核苷酸同源性比较 6
2.3 S基因编码氨基酸同源性比较 6
2.4 S基因序列比较和系统发育分析 6
3 讨论 10
致谢 11
参考文献 11
江苏及周边地区猪德尔塔冠状病毒S基因的
全长序列测定及进化分析
引言
2012年，猪德尔塔冠状病毒（porcine deltacoronavirus, PDCoV）在中国香港的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072￥
一次对哺乳动物和鸟类的冠状病毒的研究中首次被发现[1]。2014年2月，在美国猪群中检测出PDCoV，并迅速扩散到美国的多个州[2]，现已传播到中国，韩国，泰国和老挝[35]。在国内，从2014年开始，研究人员在我国江苏、安徽、湖北、黑龙江、江西、四川、山西等地的猪场粪样中均检测到 PDCoV病毒。虽然该病毒在国内还大面积扩散，但从其在美国的流行趋势及我国报到情况来看，预计该病近年内将会在我国全面发生[6]。
与PEDV和TGEV类似,PDCoV可导致细胞溶解，并且受感染的肠细胞会发生急性坏死，导致小肠中的绒毛明显萎缩，而大肠中的变化并不明显[710]。同时PDCoV可能不会诱导受感染猪小肠中的肠上皮细胞的凋亡。PDCoV抗原和核酸主要分布于小肠（十二指肠到回肠）和大肠的绒毛状肠细胞中，而在其他器官如胃，肺，心脏，扁桃体，脾脏，肝脏和肾脏中则未检测到PDCoV抗原[710]。实验攻毒的无菌猪的临床症状与PEDV和TGEV相似，此外，PDCoV还诱导急性、水样腹泻，常伴有急性轻度至中度呕吐，最终导致脱水，体重减轻，嗜睡和死亡[10, 11]。在受感染的哺乳猪中，临床正常也与PEDV和TGEV相似，大体病变局限于胃肠道，其特征为肠壁薄（空肠到结肠近端）薄而透明，肠腔内积聚大量黄色液体[710]。肚子中充满凝乳，与PEDV感染相比，肠的透明度和脆性变化似乎更轻。与PEDV和TGEV一样，PDCoV诱发的腹泻可能是由于吸收性肠细胞大量丧失进而导致的吸收不良性腹泻，肠细胞的功能障碍也可能导致吸收不良性腹泻。与PEDV相似[12]，结肠上皮细胞中的轻度空泡可能会干扰水和电解质的重要的重吸收[13]。由于肠道细胞的大量损失，在腹泻小猪的小肠中，刷状缘膜结合的消化酶例如二糖酶（乳糖酶，蔗糖酶和麦芽糖酶），亮氨酸APN和碱性磷酸酶的表达量显著降低[14]，导致消化不良性腹泻。呕吐加剧了脱水，但PDCoV诱发呕吐的机制尚不清楚。
PDCoV S基因编码的蛋白为病毒纤突蛋白，是PDCoV的主要结构蛋白，具有较高变异性[13]，常被用于病毒遗传变异分析。本课题对从江苏周边地区送检的PDCoV阳性临床病料进行S基因的全长测序及序列分析，通过对S基因进行进化树分析及氨基酸位点分析 研究PDCoV 的进化情况及抗原变异程度，为PDCoV的有效防控提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 病料与核酸
送检病料来自于江苏周边地区（安徽、湖北、广西等地）的发病猪场，核酸由大学免疫研究所实验室提取并保存。
1.1.2 主要试剂与缓冲液配方
反转录试剂盒购自Thermo公司；premix Taq，DNA Marker DL 5000购自TakaRa公司；Gel Green购自Biotium公司；琼脂糖购自Biowest公司；10×TAE缓冲液：依次将24.2 g Tris 碱, 5.71 ml 冰醋酸, 10 ml 0.5 mol/L EDTA(pH 8.0)加入400 ml超纯水中, 最后定容至500 ml；1%琼脂糖凝胶：5ml 10×TAE、45ml ddH?O、琼脂糖0.5g，加热溶解。
1.1.3 主要仪器
凝胶成像系统（BioRad公司），低温冰箱（20℃）（Haier公司）、低温冰箱（80℃）（SANYO公司）、制冰机（SANYO公司)、生物安全柜（LABCONCO公司）、微量电子天平（METTERAE260型，Deltalange公司）、去离子净水系统（Milipore公司）、PCR仪（Eppendorf AG 22331 Hamburg，德国制造）、超净工作台（Forma Scientific型，上海博逊实业有限公司）、电泳仪及电泳槽（北京六一仪器）、厂恒温水浴箱（DK80型，上海一恒科技有限公司），微波炉（格兰仕）、离心机（Beckman Coulter公司）
1.1.4分子生物学分析软件
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/247.html
