torin1在dld1细胞中诱导凋亡的作用研究
Torin1是最新发现的强效mTOR激酶抑制剂，大量试验证明它可以诱导不同细类型胞凋亡，但其诱导机制在体外培养的细胞中还不清楚，故本实验探讨Torin 1在DLD1细胞中诱导细胞凋亡的作用机制，从而为Torin 1在结肠癌的靶向治疗提供实验依据。在本研究中，利用不同浓度（0、1μM、5μM、10μM、15μM、30μM、50μM）的Torin1处理DLD1细胞，用 MTS方法检测Torin1对DLD1生长的影响，结果表明15μM Torin1对细胞生长抑制为70%；同时，用Hoechst33258染色和流式细胞仪检测Torin1对DLD1细胞凋亡的作用，二者结果都表明15μM Torin1在DLD1细胞中诱导的凋亡可以达到40-70%，同时，受体蛋白DR5在mRNA和蛋白水平上都表达上调，Caspase3表达也增强，而4E-BP1磷酸化受到抑制。若在DLD1细胞中转染DR5 siRNA，Torin1诱导的细胞凋亡减少到30%， DR5表达也减少。因此，DR5很可能是Torin1诱导DLD1细胞凋亡过程中的关键蛋白。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1 材料与方法6
1.1 细胞培养与转染准备6
1.1.1 主要试剂与耗材6
1.1.2 实验方法6
1.2 MTS法确定Torin1在DLD1细胞的作用浓度6
1.2.1 主要试剂与耗材6
1.2.2 实验方法6
1.3 Hoechst33258染色 7
1.3.1 主要试剂与耗材7
1.3.2 实验方法7
1.4 流式细胞术检测细胞凋亡7
1.4.1 主要试剂与耗材7
1.4.2 实验方法7
1.5 Realtime PCR检测7
1.5.1 主要试剂与耗材7
1.5.2 实验方法7
1.6 WesternBlot检测7
1.6.1 主要试剂与耗材7
1.6.2 主要溶液的配制8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
1.6.3 引物设计8
1.6.4 实验方法8
2 技术路线 8
3 结果与分析9
3.1 Torin1对DLD1细胞的生长有抑制作用9
3.2 Torin1在DLD1细胞中诱导细胞凋亡 10
3.3 DR5在Torin1诱导DLD1细胞凋亡时表达上调，4EBP1磷酸化受到抑制12
3.4 DR5是Torin1诱导DLD1细胞凋亡时的关键蛋白13
4 讨论 14
5 结论 14
致谢14
参考文献15
Torin1在DLD1细胞中诱导凋亡的作用研究
引言
结直肠癌（Colorectal Cancer , 后文简称CRC）是人类常见的消化道肿瘤之一[1]。正常的结直肠粘膜细胞存在着细胞凋亡现象，并都伴有凋亡小体存在，而发生癌变的黏膜细胞却恰恰相反。其中DLD1细胞的凋亡机制在维持机体结直肠内环境稳态，防止细胞恶变中有十分积极重要的生理意义[2]。反之，DLD1细胞的细胞凋亡功能失调即会显著提高CRC的罹患率。
mTOR靶向信号通路是调控DLD1细胞凋亡，辅助治疗CRC的关键（图 1）。mTOR由mTORC1和mTORC2两种不同的复合体构成（图 2）。其中mTOR蛋白及对复合体起正负调节作用的Raptor、mLST8、Ttl1/Tel2、Deptor及PRAS40等蛋白组成了mTORC 1复合体。而另一个mTOR蛋白及其附属蛋白Deptor、Protor、rictor、Ttl1/Tel2、mSINl及mLST8组成了mTORC2。mTORC1与mTORC2的活性都受到生长因子水平的调控，其中mTORC1的活性还受到应激刺激、机体氧气浓度水平、能量状态及氨基酸水平等的影响；而mTORC2则是接受核糖体的调控，进行细胞生长调控。目前对DLD1细胞的诱导主要就是通过对mTOR通路中mTORC1的抑制来实现细胞凋亡。
图 1 mTOR信号通路
Fig.1 mTOR pathway
图 2 mTOR结构相关图
Fig.2 The structure of mammalian target of rapamycin (mTOR)
在mTOR信号被过度激活的情况下，多见有DLD1细胞凋亡异常情况存在。DLD1细胞的凋亡作为细胞死亡的一种形式极大可能对CRC及其连锁疾病的转归具有意义[3],但Torin1对DLD1细胞的凋亡诱导机制的探究尚不深入。
Torin 1是近年来发现的一种极为强效和专一的mTOR激酶阻断剂[4]（图 3）。它对mTOR比对PI3K的选择性高约100倍[5]。作为新一代的mTOR通路抑制剂，相较于传统雷帕霉素衍生物，Torin1能够实现对mTORC1及mTORC2双重地更高效完全的抑制，且因其发现较晚而尚未得到全面深入的大范围试验运用及针对不同细胞相对地抑制机能机制研究。因此，本研究探讨Torin 1在DLD1细胞中诱导细胞凋亡的作用机制，从而为Torin 1对CRC靶向治疗提供实验依据。
图 3 Torin1的化学式
Fig.3 The chemical structure of Torin1
材料与方法
细胞培养与转染准备
1.1.1 主要试剂与耗材
试剂：McCoy’s5A培养原液(Hyclone公司)、Lipofectamine 2000（Dharmacon公司）、siDR5(5AAGACCCUUGUGCUCGUUGUCdTdT)（Dharmacon公司）、100μg/mL链霉素、灭菌纯净水、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清(Hyclone公司)、0. 25%的胰酶溶液(含0.02% EDTA)（上海生工生物工程有限公司）
仪器：恒温CO2培养箱（Thermo公司）、细胞培养瓶、 超净工作台（Thermo公司）、96孔细胞培养板
1.1.2 实验方法
①无菌操作条件下，由McCoy’s5A培养原液、100μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清等配制McCoy’s5A培养标准液；
②将DLD1细胞系培养于McCoy’s5A培养标准液中；
③放置在恒温细胞培养箱于5% CO2、37℃条件下进行培养；
④待DLD1细胞贴壁生长单层覆盖瓶底时，使用0. 25%的胰酶溶液(含0.02% EDTA)进行消化传代；
⑤用细胞培养瓶中再次接种；
⑥最终取对数生长期DLD1细胞以用于实验；
⑦制备转染液： 在50 μl无血清培养基分别加入300pmol DR5 siRNA和适量Lipofe ctamine 2000，混匀，于室温放置5min；然后将DR5 siRNA滴入到Lipofectamine 2000中，在室温放置20min；
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1 材料与方法6
1.1 细胞培养与转染准备6
1.1.1 主要试剂与耗材6
1.1.2 实验方法6
1.2 MTS法确定Torin1在DLD1细胞的作用浓度6
1.2.1 主要试剂与耗材6
1.2.2 实验方法6
1.3 Hoechst33258染色 7
1.3.1 主要试剂与耗材7
1.3.2 实验方法7
1.4 流式细胞术检测细胞凋亡7
1.4.1 主要试剂与耗材7
1.4.2 实验方法7
1.5 Realtime PCR检测7
1.5.1 主要试剂与耗材7
1.5.2 实验方法7
1.6 WesternBlot检测7
1.6.1 主要试剂与耗材7
1.6.2 主要溶液的配制8
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
1.6.3 引物设计8
1.6.4 实验方法8
2 技术路线 8
3 结果与分析9
3.1 Torin1对DLD1细胞的生长有抑制作用9
3.2 Torin1在DLD1细胞中诱导细胞凋亡 10
3.3 DR5在Torin1诱导DLD1细胞凋亡时表达上调，4EBP1磷酸化受到抑制12
3.4 DR5是Torin1诱导DLD1细胞凋亡时的关键蛋白13
4 讨论 14
5 结论 14
致谢14
参考文献15
Torin1在DLD1细胞中诱导凋亡的作用研究
引言
结直肠癌（Colorectal Cancer , 后文简称CRC）是人类常见的消化道肿瘤之一[1]。正常的结直肠粘膜细胞存在着细胞凋亡现象，并都伴有凋亡小体存在，而发生癌变的黏膜细胞却恰恰相反。其中DLD1细胞的凋亡机制在维持机体结直肠内环境稳态，防止细胞恶变中有十分积极重要的生理意义[2]。反之，DLD1细胞的细胞凋亡功能失调即会显著提高CRC的罹患率。
mTOR靶向信号通路是调控DLD1细胞凋亡，辅助治疗CRC的关键（图 1）。mTOR由mTORC1和mTORC2两种不同的复合体构成（图 2）。其中mTOR蛋白及对复合体起正负调节作用的Raptor、mLST8、Ttl1/Tel2、Deptor及PRAS40等蛋白组成了mTORC 1复合体。而另一个mTOR蛋白及其附属蛋白Deptor、Protor、rictor、Ttl1/Tel2、mSINl及mLST8组成了mTORC2。mTORC1与mTORC2的活性都受到生长因子水平的调控，其中mTORC1的活性还受到应激刺激、机体氧气浓度水平、能量状态及氨基酸水平等的影响；而mTORC2则是接受核糖体的调控，进行细胞生长调控。目前对DLD1细胞的诱导主要就是通过对mTOR通路中mTORC1的抑制来实现细胞凋亡。
图 1 mTOR信号通路
Fig.1 mTOR pathway
图 2 mTOR结构相关图
Fig.2 The structure of mammalian target of rapamycin (mTOR)
在mTOR信号被过度激活的情况下，多见有DLD1细胞凋亡异常情况存在。DLD1细胞的凋亡作为细胞死亡的一种形式极大可能对CRC及其连锁疾病的转归具有意义[3],但Torin1对DLD1细胞的凋亡诱导机制的探究尚不深入。
Torin 1是近年来发现的一种极为强效和专一的mTOR激酶阻断剂[4]（图 3）。它对mTOR比对PI3K的选择性高约100倍[5]。作为新一代的mTOR通路抑制剂，相较于传统雷帕霉素衍生物，Torin1能够实现对mTORC1及mTORC2双重地更高效完全的抑制，且因其发现较晚而尚未得到全面深入的大范围试验运用及针对不同细胞相对地抑制机能机制研究。因此，本研究探讨Torin 1在DLD1细胞中诱导细胞凋亡的作用机制，从而为Torin 1对CRC靶向治疗提供实验依据。
图 3 Torin1的化学式
Fig.3 The chemical structure of Torin1
材料与方法
细胞培养与转染准备
1.1.1 主要试剂与耗材
试剂：McCoy’s5A培养原液(Hyclone公司)、Lipofectamine 2000（Dharmacon公司）、siDR5(5AAGACCCUUGUGCUCGUUGUCdTdT)（Dharmacon公司）、100μg/mL链霉素、灭菌纯净水、100 U/mL青霉素、10%胎牛血清(Hyclone公司)、0. 25%的胰酶溶液(含0.02% EDTA)（上海生工生物工程有限公司）
仪器：恒温CO2培养箱（Thermo公司）、细胞培养瓶、 超净工作台（Thermo公司）、96孔细胞培养板
1.1.2 实验方法
①无菌操作条件下，由McCoy’s5A培养原液、100μg/mL链霉素、100 U/mL青霉素和10%胎牛血清等配制McCoy’s5A培养标准液；
②将DLD1细胞系培养于McCoy’s5A培养标准液中；
③放置在恒温细胞培养箱于5% CO2、37℃条件下进行培养；
④待DLD1细胞贴壁生长单层覆盖瓶底时，使用0. 25%的胰酶溶液(含0.02% EDTA)进行消化传代；
⑤用细胞培养瓶中再次接种；
⑥最终取对数生长期DLD1细胞以用于实验；
⑦制备转染液： 在50 μl无血清培养基分别加入300pmol DR5 siRNA和适量Lipofe ctamine 2000，混匀，于室温放置5min；然后将DR5 siRNA滴入到Lipofectamine 2000中，在室温放置20min；
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