苏皖地区副猪嗜血杆菌分离株的血清型鉴定及其耐药性分析
：本研究对2013-2016年间江苏、安徽地区的部分规模化猪场发病猪群中分离到的副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）进行了鉴定分析。首先用染色镜检和Hps16sDNA的PCR扩增，鉴定得到19株副猪嗜血杆菌分离株，然后采用多重PCR（Multiple-PCR）方法对这19株Hps进行了基因型的分型，获得了所有菌株对应的血清型。之后对19株分离株进行了药敏实验。结果表明，不同来源的19株分离株对所选用的4大类、9种不同药物表现出程度各异的耐药性状，且存在多重耐药现象，其中有1株分离株表现出同时对5种药物耐受。4种对应的主要耐药基因检测结果显示，β-内酰胺类耐药基因Tem-11的检出率为47.34%，耐四环素类基因Tet-B的检出率为21.05%，耐氨基糖苷类基因AadA1的检出率为21.05%，耐喹诺酮类基因的检出率为10.53%。该研究为近期华东地区的副猪嗜血感染的流行病学和药物使用提供了理论数据。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1 材料与方法5
1.1 材料 5
1.1.1 病料来源 5
1.1.2 菌株来源 5
1.1.3 主要试剂 5
1.1.4 试剂配制 6
1.1.5 主要仪器 6
1.2 方法 6
1.2.1 分离6
1.2.2 细菌的镜检7
1.2.3 细菌的扩增7
1.2.4 细菌核酸的提取7
1.2.5 PCR鉴定7
1.2.6 多重PCR血清型鉴定7
1.2.7 四类耐药基因的PCR检测 8
1.2.8 药敏试验9
2 结果与分析9
2.1 分离株的血清型鉴定9
2.1.1 菌落及菌体形态特征9
2.1.2 临床分离株的鉴定9
2.1.3 多重PCR法鉴定血清型10
2.2 耐药性试验11
2.2.1 药敏试验结果11
2.2.2 多重耐药分析12
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.2.3 分离株耐药谱12
2.2.4 耐药基因检测结果12
2.2.5 耐药基因的分析12
3 讨论14
3.1 多重PCR法对副猪嗜血杆菌的血清型鉴定14
3.2 副猪嗜血杆菌的耐药表现15
3.3 耐药基因与耐药表型分析16
致谢16
参考文献16
我国苏皖地区副猪嗜血杆菌分离株的
血清型鉴定及其耐药性分析
引言
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）是猪格拉泽氏病(Glasser’s)的病原，是一种条件性致病菌。正常猪群携带有该菌并不会引起严重感染，一旦外界影响引起机体的免疫水平发生改变，即会引起发病。临床上Hps可单独引发感染，与其他病原菌也有普遍的混合感染现象（如猪瘟病毒、流感病毒、圆环病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒）[12]。该菌临床多见于2周龄至4月龄的猪，尤其58周龄保育猪，其发病率10%15%，死亡率达50%。典型的症状多表现为关节炎、多发性浆膜炎和脑膜炎,病猪常具有发热、呼吸困难和咳喘症状。病理剖检可见胸膜炎、腹膜炎，常于心肌、肺部和后肢关节处出现大量渗出，严重时出现明显的“绒毛心”现象。猪群发病后会给猪养殖户带来巨大的经济损失[26]。近年来Hps感染有明显上升的趋势[7]，已逐渐发展成为世界性的猪传染性疾病[8]。目前主要通过疫苗及抗菌药物的使用对Hps引起的感染进行防控。
由于Hps各血清型之间的交叉保护力较弱，常常导致疫苗使用后免疫失败，因此准确鉴定Hps分离株的血清型对自家苗的生产十分关键。临床上运用传统的血清学方法对Hps进行亚型的鉴定，如协同凝集试验（CA）、间接血凝试验（IHA）和琼脂免疫扩散试验（GD）。这些方法能够将Hps分成15种血清型，但都存在一定的缺陷，如耗时长、过程繁琐，且试验前必需获得15种血清型标准菌株的高免血清，这使血清学分型方法很难得到大范围的实验室的普及。基因分型法往往能解决这些缺点，因此许多研究已经开始运用更准确和便捷的基因分型方法对该菌进行血清分型，如肠杆菌基因间重复共有序列PCR（ERICPCR），这些方法各有优劣[919]。Kate等人于2015年利用Hps不同血清型菌株荚膜位点的差异，设计了分别对应15种血清型的14对特异性引物（其中5型和12型由于具有相似的荚膜位点共用一对引物），并由此建立了一种多重PCR的血清型鉴定方法。该方法具有很强的特异性，操作简单、耗时短、敏感程度高，十分适合运用于临床上对Hps血清型的快速鉴定。本实验将利用该多重PCR方法，对分离自20132016年江苏及安徽部分规模化猪场的Hps菌株进行血清学鉴定。
除疫苗接种外，抗菌药物的使用也是控制Hps感染的有效手段，但由此导致了Hps对抗菌药物的敏感性程度逐渐发生了改变[20]。据近几年的报道，Hps对抗菌药物的耐药性越来越严重，且表现出明显的地域性差异[2123]。许多研究表明，Hps的耐药性的产生与菌体携带的耐药基因有关[1]，对Hps耐药基因携带情况的流行病学调查显示，AadA1、Aac（6’）1b、TetB、Cat1、Sul1、Tem11分别是Hps对氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、磺胺类、?内酰胺类抗菌药物的主要耐药基因[24]。本试验选择了四类药物中的9种药进行了药敏试验和对应主要耐药基因的检测。在药敏试验的基础上，分析了Hps华东地区部分规模化猪场的临床分离株的耐喹诺酮类基因AadA1、耐氨基糖苷类基因Aac（6’）1b、耐四环素类基因TetB、耐?内酰胺类基因Tem11四种耐药基因的携带情况和其对应耐药表型的表现，为我国华东地区副猪嗜血杆菌的防治和研究提供实验依据。
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1病料来源
由本实验室采自20132016年期间从江苏、安徽的11个市区的规模化猪场副猪嗜血杆菌感染病死猪的病变肺脏、心脏、淋巴结、胸腔积液及关节液。经分离鉴定后，部分以甘油菌保存于80℃，部分制成冻干菌苗保存于20℃。
1．1．2菌株来源
Hps临床分离株由病料直接分离或甘油菌和冻干菌苗经复苏、分离纯化、扩增后获得。
1．1．3主要试剂
9种药物的药敏片均购自杭州天和微生物试剂研究公司：
?内酰胺类：青霉素G（penicillin G，PEN）、氨苄西林（ampicillin，AMP）、头孢吡肟（cefepime，CEFE）、 头孢他啶（ceftazidime，CEFT）；
氨基糖苷类：链霉素（streptomycin，STR）、卡那霉素（kanamycin，KAN）；
喹诺酮类：环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氟沙星（levofloxacin，LEV）；
四环素类：四环素（tetracycline，TET）；
新生牛血清，购自浙江天杭四季青生物科技有限公司，使用前经56℃，30min灭活。
YE（yeast extract）、TSB（tryptone soya broth，胰蛋白大豆肉汤）、琼脂糖均购自OXOID公司。
目录
摘要4
关键词4
Abstract4
Key words4
引言4
1 材料与方法5
1.1 材料 5
1.1.1 病料来源 5
1.1.2 菌株来源 5
1.1.3 主要试剂 5
1.1.4 试剂配制 6
1.1.5 主要仪器 6
1.2 方法 6
1.2.1 分离6
1.2.2 细菌的镜检7
1.2.3 细菌的扩增7
1.2.4 细菌核酸的提取7
1.2.5 PCR鉴定7
1.2.6 多重PCR血清型鉴定7
1.2.7 四类耐药基因的PCR检测 8
1.2.8 药敏试验9
2 结果与分析9
2.1 分离株的血清型鉴定9
2.1.1 菌落及菌体形态特征9
2.1.2 临床分离株的鉴定9
2.1.3 多重PCR法鉴定血清型10
2.2 耐药性试验11
2.2.1 药敏试验结果11
2.2.2 多重耐药分析12
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
2.2.3 分离株耐药谱12
2.2.4 耐药基因检测结果12
2.2.5 耐药基因的分析12
3 讨论14
3.1 多重PCR法对副猪嗜血杆菌的血清型鉴定14
3.2 副猪嗜血杆菌的耐药表现15
3.3 耐药基因与耐药表型分析16
致谢16
参考文献16
我国苏皖地区副猪嗜血杆菌分离株的
血清型鉴定及其耐药性分析
引言
副猪嗜血杆菌（Haemophilus parasuis，Hps）是猪格拉泽氏病(Glasser’s)的病原，是一种条件性致病菌。正常猪群携带有该菌并不会引起严重感染，一旦外界影响引起机体的免疫水平发生改变，即会引起发病。临床上Hps可单独引发感染，与其他病原菌也有普遍的混合感染现象（如猪瘟病毒、流感病毒、圆环病毒、猪繁殖与呼吸道综合征病毒）[12]。该菌临床多见于2周龄至4月龄的猪，尤其58周龄保育猪，其发病率10%15%，死亡率达50%。典型的症状多表现为关节炎、多发性浆膜炎和脑膜炎,病猪常具有发热、呼吸困难和咳喘症状。病理剖检可见胸膜炎、腹膜炎，常于心肌、肺部和后肢关节处出现大量渗出，严重时出现明显的“绒毛心”现象。猪群发病后会给猪养殖户带来巨大的经济损失[26]。近年来Hps感染有明显上升的趋势[7]，已逐渐发展成为世界性的猪传染性疾病[8]。目前主要通过疫苗及抗菌药物的使用对Hps引起的感染进行防控。
由于Hps各血清型之间的交叉保护力较弱，常常导致疫苗使用后免疫失败，因此准确鉴定Hps分离株的血清型对自家苗的生产十分关键。临床上运用传统的血清学方法对Hps进行亚型的鉴定，如协同凝集试验（CA）、间接血凝试验（IHA）和琼脂免疫扩散试验（GD）。这些方法能够将Hps分成15种血清型，但都存在一定的缺陷，如耗时长、过程繁琐，且试验前必需获得15种血清型标准菌株的高免血清，这使血清学分型方法很难得到大范围的实验室的普及。基因分型法往往能解决这些缺点，因此许多研究已经开始运用更准确和便捷的基因分型方法对该菌进行血清分型，如肠杆菌基因间重复共有序列PCR（ERICPCR），这些方法各有优劣[919]。Kate等人于2015年利用Hps不同血清型菌株荚膜位点的差异，设计了分别对应15种血清型的14对特异性引物（其中5型和12型由于具有相似的荚膜位点共用一对引物），并由此建立了一种多重PCR的血清型鉴定方法。该方法具有很强的特异性，操作简单、耗时短、敏感程度高，十分适合运用于临床上对Hps血清型的快速鉴定。本实验将利用该多重PCR方法，对分离自20132016年江苏及安徽部分规模化猪场的Hps菌株进行血清学鉴定。
除疫苗接种外，抗菌药物的使用也是控制Hps感染的有效手段，但由此导致了Hps对抗菌药物的敏感性程度逐渐发生了改变[20]。据近几年的报道，Hps对抗菌药物的耐药性越来越严重，且表现出明显的地域性差异[2123]。许多研究表明，Hps的耐药性的产生与菌体携带的耐药基因有关[1]，对Hps耐药基因携带情况的流行病学调查显示，AadA1、Aac（6’）1b、TetB、Cat1、Sul1、Tem11分别是Hps对氨基糖苷类、喹诺酮类、四环素类、氯霉素类、磺胺类、?内酰胺类抗菌药物的主要耐药基因[24]。本试验选择了四类药物中的9种药进行了药敏试验和对应主要耐药基因的检测。在药敏试验的基础上，分析了Hps华东地区部分规模化猪场的临床分离株的耐喹诺酮类基因AadA1、耐氨基糖苷类基因Aac（6’）1b、耐四环素类基因TetB、耐?内酰胺类基因Tem11四种耐药基因的携带情况和其对应耐药表型的表现，为我国华东地区副猪嗜血杆菌的防治和研究提供实验依据。
1 材料与方法
1．1材料
1．1．1病料来源
由本实验室采自20132016年期间从江苏、安徽的11个市区的规模化猪场副猪嗜血杆菌感染病死猪的病变肺脏、心脏、淋巴结、胸腔积液及关节液。经分离鉴定后，部分以甘油菌保存于80℃，部分制成冻干菌苗保存于20℃。
1．1．2菌株来源
Hps临床分离株由病料直接分离或甘油菌和冻干菌苗经复苏、分离纯化、扩增后获得。
1．1．3主要试剂
9种药物的药敏片均购自杭州天和微生物试剂研究公司：
?内酰胺类：青霉素G（penicillin G，PEN）、氨苄西林（ampicillin，AMP）、头孢吡肟（cefepime，CEFE）、 头孢他啶（ceftazidime，CEFT）；
氨基糖苷类：链霉素（streptomycin，STR）、卡那霉素（kanamycin，KAN）；
喹诺酮类：环丙沙星（ciprofloxacin，CIP）、左氟沙星（levofloxacin，LEV）；
四环素类：四环素（tetracycline，TET）；
新生牛血清，购自浙江天杭四季青生物科技有限公司，使用前经56℃，30min灭活。
YE（yeast extract）、TSB（tryptone soya broth，胰蛋白大豆肉汤）、琼脂糖均购自OXOID公司。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/888.html
