三聚氰胺对小鼠卵子的毒性作用
随着2008年三聚氰胺毒奶粉事件的爆发，三聚氰胺毒性作用的研究引发广泛关注。为了研究三聚氰胺对雌性小鼠生殖系统，特别是对卵子的毒性作用。本实验选取45只健康小鼠随机分为3组，分别口服暴露三聚氰胺0,10,50mg/kg/d，自由采食饮水，8周后处死，称取卵巢重量，切片染色观察组织形态，提取卵子，检测异卵率，荧光标记检测ROS水平。结果发现，10和50mg/kg/d三聚氰胺组卵巢明显小于对照组，且卵巢重量（40±7.5 mg和37±8.3 mg）显著低于对照组小鼠（49±4.3mg）。实验组异常卵率分别为（14.3±1.4％）和（21.8 ±1.7％），而对照组则为（13± 0.44％），高剂量三聚氰胺组和对照组相比差异显著（P＜0.05）。对小鼠卵母细胞核中ROS水平进行荧光强度测定发现，实验组荧光强度大于对照组。综上，三聚氰胺对小鼠卵子具有毒性作用，能降低卵子的质量，进而危害雌性生殖系统的正常生理机能。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1动物饲养与采样2
1.2.2 ROS水平检测2
1.2.3卵巢样品组织形态学观察2
2结果与分析2
2.1卵巢形态的变化2
2.2卵巢内卵泡质量变化3
2.3卵子质量的下降3
2.4卵子氧化应激情况4
3讨论5
3.1卵巢形态的变化5
3.2卵子内的氧化应激5
3.3三聚氰胺毒性表现可能的其他方式6
致谢6
参考文献6
三聚氰胺对小鼠卵子的毒性作用
引言
三聚氰胺(Melamine)分子式C3H6N6，相对分子质量126.12，是一种三类含氮杂环有机化合物，又称蛋白精[1]。广泛应用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。除了人为掺入，三嗪类农药、兽药以及三聚氰胺在多种日常生活用具材料中的应用也可能是污染的稳定来源[2]。因为三聚氰胺的含氮量高，有不法分子将其作为添 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
加剂掺入食品和饲料，从而引起凯氏定氮法中蛋白质含量表观上的提高，同时还可以大幅降低生产成本，以使劣质食品通过食品检验机构的测试[3]。
2008年，三聚氰胺毒奶粉事件引起了广泛的关注。目前有关三聚氰胺毒性研究多集中其肾脏毒性，包括肾结石，肾小管坏死，结晶尿和血尿的形成[45]。最近的一项研究表明，摄入三聚氰胺将导致精子异常，精子DNA损伤[6]，也影响雄性生殖系统[7]。然而，目前对于雌性生殖系统，特别是卵母细胞质量研究较少。因此本文拟小鼠卵子为试验材料，分析三聚氰胺对小鼠卵子的毒性作用，观察卵巢形态、卵泡质量、卵子质量的变化情况并测定卵子内氧化应激水平，为进一步研究三聚氰胺对生殖系统影响作用，探索损伤发生机理提供理论依据。
材料与方法
1.1材料
4周龄生长发育、生理健康状态相似雌性ICR小鼠45只，购于南京青龙山动物繁殖场；光学显微镜Nikon YS100以及光学成像系统Nikon 80i，购于日本Nikon株式会社聚焦扫描显微镜（Carl Zeiss 700）；红色荧光测定试剂盒，购于上海杰美基因医药科技有限公司；hoechst 33342染料，购于德国Hoechst AG公司；HE（苏木精伊红）染液，购于南京建成生物科技有限公司；动物切片石蜡（熔点6062℃），购于上海国药集团化学试剂有限公司；全自动生物组织包埋机，购于浙江省金华市医疗设备厂；石蜡切片机Leica RM2235，购于上海徕卡仪器有限公司；展片机，购于浙江省金华市科迪仪器设备厂；烘片机Leica HI1220，购于上海徕卡仪器有限公司；恒温水浴锅，上海一科仪器设备有限公司；多聚甲醛，购于正峰化学试剂有限公司；。
1.2方法
1.2.1 动物饲养与采样
动物饲养和使用处于大学动物实验伦理委员会指导和监督之下，小鼠饲养于2023℃恒温环境，12:12光照周期，自由饮水采食。随机分为三组，分别口服暴露三聚氰胺0，10，50mg/kg/d 8周，观察其表观和行为学变化。之后将小鼠处死，采集卵巢样品、称重，并提取卵母细胞处于培养基中备用。
1.2.2 ROS水平检测
在5％CO2环境下利用红色荧光测定试剂盒标记处理细胞内的ROS 30分钟，并在37℃下用Hoechst 33342（在PBS中的10微克/毫升）10分钟染色。最后，将卵母细胞安装在载玻片上，于激光共聚焦扫描显微镜下观察。
1.2.3卵巢样品组织形态学观察
将卵巢样品处于4℃下用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）固定于4％低聚甲醛中，过夜。固定后，将组织脱水，包埋在石蜡中，连续切片（5毫米），安装在载玻片上，并用HE（苏木精和伊红）染色。将切片于数字虚拟显微镜下扫描观察。
2 结果与分析
2．1 卵巢形态的变化
实验期间，对照组和实验组小鼠在行为学变化和体重方面没有显著差异，但10和50mg/kg/d三聚氰胺组卵巢明显小于对照组，且卵巢重量（40±7.5 mg和37±8.3 mg）显著低于对照组小鼠（49±4.3mg；图1A和图1B）。
A：卵巢形态外观；B: 卵巢重量
图1卵巢形态检测结果
2．2 卵巢内卵泡质量的变化
闭锁卵泡使用标准方法鉴定[8]：如果包含10个以上固缩的细胞核，颗粒细胞杂乱无章，或者卵母细胞细胞核支离破碎，可被认为是闭锁卵泡。通过HE染色观察发现，实验组卵巢中颗粒细胞零散，卵母细胞退化，闭锁卵泡增多（图2）。
空白组：三聚氰胺0mg/kg/d；低组: 三聚氰胺10mg/kg/d；高组：三聚氰胺50mg/kg/d
图2卵巢组织切片染色结果
2．3 卵子质量的下降
通过研究卵母细胞于生发泡（GV）阶段的状态发现，对照组小鼠卵母细胞大多有一个明净透亮的细胞质并保持正常形态。然而，实验组小鼠卵母细胞形态尺寸较小或者拥有暗细胞质的比率很高（图3）。实验组异常卵率（10mg/kg/d组的14.3±1.4％，N= 335 ；50mg/kg/d组:21.8±1.7％，N= 356），而对照组则为（13± 0.44％，N= 373，N为卵母细胞数），并且高剂量三聚氰胺组和对照组相比差异显著（P＜0.05）（图4）。
图3卵子于生发泡阶段形态
图4异卵率检测结果
2．4 卵子氧化应激情况
通过免疫荧光标记卵母细胞观察发现，与对照组GV阶段的卵母细胞相比，实验组的卵母细胞核内已经积累了很大斑点（图5）。
图5荧光染色激光共聚焦显微镜观察结果
3 讨论
3．1 卵巢形态的变化
先前的研究表明，雄性小鼠口服三聚氰胺导致身体和器官重量显著减少[9]。本实验的结果表明三聚氰胺处理后雌性小鼠卵巢重量显著减少，具有相似的效果。卵母细胞形态和细胞质对卵母细胞成熟、受精和胚胎质量来说至关重要[10]。三聚氰胺实验组的小鼠，部分卵母细胞尺寸小于对照组或者卵母细胞中有一个黑色的细胞质，这对卵巢正常功能的发挥带来负面影响。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 2
1.2.1动物饲养与采样2
1.2.2 ROS水平检测2
1.2.3卵巢样品组织形态学观察2
2结果与分析2
2.1卵巢形态的变化2
2.2卵巢内卵泡质量变化3
2.3卵子质量的下降3
2.4卵子氧化应激情况4
3讨论5
3.1卵巢形态的变化5
3.2卵子内的氧化应激5
3.3三聚氰胺毒性表现可能的其他方式6
致谢6
参考文献6
三聚氰胺对小鼠卵子的毒性作用
引言
三聚氰胺(Melamine)分子式C3H6N6，相对分子质量126.12，是一种三类含氮杂环有机化合物，又称蛋白精[1]。广泛应用于木材、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革、电气、医药等行业。除了人为掺入，三嗪类农药、兽药以及三聚氰胺在多种日常生活用具材料中的应用也可能是污染的稳定来源[2]。因为三聚氰胺的含氮量高，有不法分子将其作为添 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
加剂掺入食品和饲料，从而引起凯氏定氮法中蛋白质含量表观上的提高，同时还可以大幅降低生产成本，以使劣质食品通过食品检验机构的测试[3]。
2008年，三聚氰胺毒奶粉事件引起了广泛的关注。目前有关三聚氰胺毒性研究多集中其肾脏毒性，包括肾结石，肾小管坏死，结晶尿和血尿的形成[45]。最近的一项研究表明，摄入三聚氰胺将导致精子异常，精子DNA损伤[6]，也影响雄性生殖系统[7]。然而，目前对于雌性生殖系统，特别是卵母细胞质量研究较少。因此本文拟小鼠卵子为试验材料，分析三聚氰胺对小鼠卵子的毒性作用，观察卵巢形态、卵泡质量、卵子质量的变化情况并测定卵子内氧化应激水平，为进一步研究三聚氰胺对生殖系统影响作用，探索损伤发生机理提供理论依据。
材料与方法
1.1材料
4周龄生长发育、生理健康状态相似雌性ICR小鼠45只，购于南京青龙山动物繁殖场；光学显微镜Nikon YS100以及光学成像系统Nikon 80i，购于日本Nikon株式会社聚焦扫描显微镜（Carl Zeiss 700）；红色荧光测定试剂盒，购于上海杰美基因医药科技有限公司；hoechst 33342染料，购于德国Hoechst AG公司；HE（苏木精伊红）染液，购于南京建成生物科技有限公司；动物切片石蜡（熔点6062℃），购于上海国药集团化学试剂有限公司；全自动生物组织包埋机，购于浙江省金华市医疗设备厂；石蜡切片机Leica RM2235，购于上海徕卡仪器有限公司；展片机，购于浙江省金华市科迪仪器设备厂；烘片机Leica HI1220，购于上海徕卡仪器有限公司；恒温水浴锅，上海一科仪器设备有限公司；多聚甲醛，购于正峰化学试剂有限公司；。
1.2方法
1.2.1 动物饲养与采样
动物饲养和使用处于大学动物实验伦理委员会指导和监督之下，小鼠饲养于2023℃恒温环境，12:12光照周期，自由饮水采食。随机分为三组，分别口服暴露三聚氰胺0，10，50mg/kg/d 8周，观察其表观和行为学变化。之后将小鼠处死，采集卵巢样品、称重，并提取卵母细胞处于培养基中备用。
1.2.2 ROS水平检测
在5％CO2环境下利用红色荧光测定试剂盒标记处理细胞内的ROS 30分钟，并在37℃下用Hoechst 33342（在PBS中的10微克/毫升）10分钟染色。最后，将卵母细胞安装在载玻片上，于激光共聚焦扫描显微镜下观察。
1.2.3卵巢样品组织形态学观察
将卵巢样品处于4℃下用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）固定于4％低聚甲醛中，过夜。固定后，将组织脱水，包埋在石蜡中，连续切片（5毫米），安装在载玻片上，并用HE（苏木精和伊红）染色。将切片于数字虚拟显微镜下扫描观察。
2 结果与分析
2．1 卵巢形态的变化
实验期间，对照组和实验组小鼠在行为学变化和体重方面没有显著差异，但10和50mg/kg/d三聚氰胺组卵巢明显小于对照组，且卵巢重量（40±7.5 mg和37±8.3 mg）显著低于对照组小鼠（49±4.3mg；图1A和图1B）。
A：卵巢形态外观；B: 卵巢重量
图1卵巢形态检测结果
2．2 卵巢内卵泡质量的变化
闭锁卵泡使用标准方法鉴定[8]：如果包含10个以上固缩的细胞核，颗粒细胞杂乱无章，或者卵母细胞细胞核支离破碎，可被认为是闭锁卵泡。通过HE染色观察发现，实验组卵巢中颗粒细胞零散，卵母细胞退化，闭锁卵泡增多（图2）。
空白组：三聚氰胺0mg/kg/d；低组: 三聚氰胺10mg/kg/d；高组：三聚氰胺50mg/kg/d
图2卵巢组织切片染色结果
2．3 卵子质量的下降
通过研究卵母细胞于生发泡（GV）阶段的状态发现，对照组小鼠卵母细胞大多有一个明净透亮的细胞质并保持正常形态。然而，实验组小鼠卵母细胞形态尺寸较小或者拥有暗细胞质的比率很高（图3）。实验组异常卵率（10mg/kg/d组的14.3±1.4％，N= 335 ；50mg/kg/d组:21.8±1.7％，N= 356），而对照组则为（13± 0.44％，N= 373，N为卵母细胞数），并且高剂量三聚氰胺组和对照组相比差异显著（P＜0.05）（图4）。
图3卵子于生发泡阶段形态
图4异卵率检测结果
2．4 卵子氧化应激情况
通过免疫荧光标记卵母细胞观察发现，与对照组GV阶段的卵母细胞相比，实验组的卵母细胞核内已经积累了很大斑点（图5）。
图5荧光染色激光共聚焦显微镜观察结果
3 讨论
3．1 卵巢形态的变化
先前的研究表明，雄性小鼠口服三聚氰胺导致身体和器官重量显著减少[9]。本实验的结果表明三聚氰胺处理后雌性小鼠卵巢重量显著减少，具有相似的效果。卵母细胞形态和细胞质对卵母细胞成熟、受精和胚胎质量来说至关重要[10]。三聚氰胺实验组的小鼠，部分卵母细胞尺寸小于对照组或者卵母细胞中有一个黑色的细胞质，这对卵巢正常功能的发挥带来负面影响。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/765.html
