纯种史宾格犬17个str基因座的遗传多态性分析
目的: 研究纯种史宾格犬的遗传多态性，建立一套简便高效的犬个体识别和亲权鉴定检测方法。方法: 选择17个STR基因座，应用五色荧光标记技术，对80头纯种史宾格犬的遗传多态性进行检测分析。结果: 17个犬STR基因座复合扩增体系，各个基因座扩增平衡，结果稳定；17个STR 基因座共检测到 155 个等位基因，平均每个STR基因座9.1个等位基因；平均杂合度(H)和平均多态信息含量( PIC)分别为0.899 和0.815，远大于0.5；而累积非父排除率(CPE) 和累积个体识别率(TDP) 分别为0.9999999999999999 和0.9999999999999999。结论:这17个STR基因座建立的荧光标记复合扩增体系，可以有效用于犬的个体识别和亲权鉴定，用于指导犬的繁育。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 样本的采集 2
1.1.2 主要仪器 2
1.1.3 主要试剂 2
1.2 实验方法2
1.2.1 DNA的提取2
1.2.2 DNA样品质量鉴定3
1.2.3 引物设计3
1.2.4 PCR扩增体系4
1.2.5 PCR扩增热循环参数4
1.2.6 PCR产物的分离检测与等位基因分型4
1.2.7 数据分析统计4
2 结果4
2.1 部分DNA样本扩增电泳图4
2.2 基因分布的检测6
3 讨论9
致谢9
参考文献9
纯种史宾格犬17个STR基因座的遗传多态性分析
引言
微卫星( microsatellite) ,又称短串联重复序列( short tandem repeat), 简称STR， 其核心重复序列为2～6bp左右，广泛分布于真核生物基因组内，广泛应用于遗传图谱的制作、基因定位及人类法医DNA检测、动物个体识别及亲权鉴定等领域。1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
974年skirmer[1]在蟹的DNA中最早发现了微卫星,1989年Litt和Luty[2]最先扩增得到了人类基因组微卫星序列,并把这种短串联重复序列正式定义为微卫星, 随后研究者们又在绵羊、马、牛、猪、鸡[36]等动物中陆续筛选到微卫星。微卫星DNA也广泛遍布于犬的基因组中，近年来国内外纷纷开展关于犬微卫星多态性的研究[79],目前已发现的犬STR有近四千个[10,11]。应用微卫星标记研究犬的遗传多态性，建立个体识别和亲权鉴定的方法，在犬的繁殖和选育中具有很大的意义。
本试验选用17个STR基因座对纯种史宾格犬的遗传多态性进行分析，并在此基础上构建了一套荧光标记复合扩增体系，建立了科学高效便捷的犬亲权鉴定方法，可用于指
导纯种犬的繁育，为犬品种的亲缘关系鉴定、个体识别和种质资源保护以及科学开发利用奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 样本的采集
本实验所用样本80只纯种史宾格犬来自南京某犬场，用75%乙醇消毒犬的前肢静脉，用一次性使用的采血针真空静脉采血3～5mL(ACD抗凝),用冰瓶带回实验室置20℃保存备用。
1. 1. 2 主要仪器
ABI3130基因分析仪:美国ABI公司
NA24T小型核酸分离提取仪(KURABO)
蛋白质核酸检测仪:eppendorf
PCR扩增仪:MJ Research
微量移液器: eppendorf
MLS3750型全自动灭菌锅(日本SANYO公司)
MulliQ超纯水系统（Millipore公司)
电泳槽:北京六一仪器厂
DYYⅢ12型电脑恒功率多功能电泳仪:北京六一仪器厂
冷冻离心机: eppendorf
TGL16G高速台式离心机:上海安亭科学仪器厂
CP224S电子天平:Sartorius
HY1型自动旋转式混匀仪:江苏兴化分析仪器厂
H1微型混合器:上海彭氏实业有限公司
1. 1. 3 主要试剂
TaqDNA聚合酶和dNTPs：大连宝生物工程有限公司
引物标记和荧光合成：上海生工
血液基因组DNA提取试剂盒：BIOMIGA
3130系列POP4液体分离胶、毛细管电泳BUFFER(25mL)、高纯甲酬安(25mL)、分子量内标(GENESCANLizi500)、毛细管(CAPILLARYA ARRAY,4x36cm)、96孔反应板和Septa(隔片)等其他耗材均购自上海欧比特公司(ABI代理)。
1．2 实验方法
1. 2. 1 DNA 的提取
用血液基因组DNA提取试剂盒从犬的血液中提取基因组DNA。此方法特别适用于从1250μL新鲜或冰冻血液样品提取基因组DNA 。
操作步骤：
将样品转移至1.5mL离心管，若样品不足250μL,加入PBS补至250μL；若样品量多余250μL，加入12.5倍体积的红细胞裂解液，颠倒5次混匀。10000rpm离心1分钟，吸去上清，加入250μL PBS，颠倒数次混匀。
加入25μL蛋白酶K和250μL Buffer BL。最大速度涡旋10秒以混匀，若要求无RNA污染，每个样品中加入5μL RNase A。
50℃温浴20分钟左右，期间涡旋一次。
向裂解液中加入260μL无水乙醇，充分颠倒混匀，瞬时离心收集上清。
将一个DNA吸附柱插入2mL收集管，将样品液加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。
向吸附柱中加入500μL Buffer KB，12000rpm离心30秒，弃去收集管与废液。
将吸附柱放入一个新的收集管中，加入650μL Wash Buffer，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。
再次用450μL Wash Buffer 漂洗，离心后倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。
12000rpm开盖离心1分钟。
将DNA吸附柱插入1.5mL离心管，向吸附柱中加入100150μL预热（65℃）Elution Buffer。室温静置5分钟。
大于等于13000rpm离心1分钟洗脱DNA，第一次洗脱通常得到60％70％DNA。
用100μL预热（65℃）Elution Buffer再次洗脱DNA，第二次洗脱可收获另外20％的DNA。
1．2．2 DNA样品质量鉴定
蛋白核酸检测仪快速准确地检出DNA的含量和纯度。纯度以0D260与OD280的比值表
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 材料 2
1.1.1 样本的采集 2
1.1.2 主要仪器 2
1.1.3 主要试剂 2
1.2 实验方法2
1.2.1 DNA的提取2
1.2.2 DNA样品质量鉴定3
1.2.3 引物设计3
1.2.4 PCR扩增体系4
1.2.5 PCR扩增热循环参数4
1.2.6 PCR产物的分离检测与等位基因分型4
1.2.7 数据分析统计4
2 结果4
2.1 部分DNA样本扩增电泳图4
2.2 基因分布的检测6
3 讨论9
致谢9
参考文献9
纯种史宾格犬17个STR基因座的遗传多态性分析
引言
微卫星( microsatellite) ,又称短串联重复序列( short tandem repeat), 简称STR， 其核心重复序列为2～6bp左右，广泛分布于真核生物基因组内，广泛应用于遗传图谱的制作、基因定位及人类法医DNA检测、动物个体识别及亲权鉴定等领域。1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
974年skirmer[1]在蟹的DNA中最早发现了微卫星,1989年Litt和Luty[2]最先扩增得到了人类基因组微卫星序列,并把这种短串联重复序列正式定义为微卫星, 随后研究者们又在绵羊、马、牛、猪、鸡[36]等动物中陆续筛选到微卫星。微卫星DNA也广泛遍布于犬的基因组中，近年来国内外纷纷开展关于犬微卫星多态性的研究[79],目前已发现的犬STR有近四千个[10,11]。应用微卫星标记研究犬的遗传多态性，建立个体识别和亲权鉴定的方法，在犬的繁殖和选育中具有很大的意义。
本试验选用17个STR基因座对纯种史宾格犬的遗传多态性进行分析，并在此基础上构建了一套荧光标记复合扩增体系，建立了科学高效便捷的犬亲权鉴定方法，可用于指
导纯种犬的繁育，为犬品种的亲缘关系鉴定、个体识别和种质资源保护以及科学开发利用奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 样本的采集
本实验所用样本80只纯种史宾格犬来自南京某犬场，用75%乙醇消毒犬的前肢静脉，用一次性使用的采血针真空静脉采血3～5mL(ACD抗凝),用冰瓶带回实验室置20℃保存备用。
1. 1. 2 主要仪器
ABI3130基因分析仪:美国ABI公司
NA24T小型核酸分离提取仪(KURABO)
蛋白质核酸检测仪:eppendorf
PCR扩增仪:MJ Research
微量移液器: eppendorf
MLS3750型全自动灭菌锅(日本SANYO公司)
MulliQ超纯水系统（Millipore公司)
电泳槽:北京六一仪器厂
DYYⅢ12型电脑恒功率多功能电泳仪:北京六一仪器厂
冷冻离心机: eppendorf
TGL16G高速台式离心机:上海安亭科学仪器厂
CP224S电子天平:Sartorius
HY1型自动旋转式混匀仪:江苏兴化分析仪器厂
H1微型混合器:上海彭氏实业有限公司
1. 1. 3 主要试剂
TaqDNA聚合酶和dNTPs：大连宝生物工程有限公司
引物标记和荧光合成：上海生工
血液基因组DNA提取试剂盒：BIOMIGA
3130系列POP4液体分离胶、毛细管电泳BUFFER(25mL)、高纯甲酬安(25mL)、分子量内标(GENESCANLizi500)、毛细管(CAPILLARYA ARRAY,4x36cm)、96孔反应板和Septa(隔片)等其他耗材均购自上海欧比特公司(ABI代理)。
1．2 实验方法
1. 2. 1 DNA 的提取
用血液基因组DNA提取试剂盒从犬的血液中提取基因组DNA。此方法特别适用于从1250μL新鲜或冰冻血液样品提取基因组DNA 。
操作步骤：
将样品转移至1.5mL离心管，若样品不足250μL,加入PBS补至250μL；若样品量多余250μL，加入12.5倍体积的红细胞裂解液，颠倒5次混匀。10000rpm离心1分钟，吸去上清，加入250μL PBS，颠倒数次混匀。
加入25μL蛋白酶K和250μL Buffer BL。最大速度涡旋10秒以混匀，若要求无RNA污染，每个样品中加入5μL RNase A。
50℃温浴20分钟左右，期间涡旋一次。
向裂解液中加入260μL无水乙醇，充分颠倒混匀，瞬时离心收集上清。
将一个DNA吸附柱插入2mL收集管，将样品液加入吸附柱中，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。
向吸附柱中加入500μL Buffer KB，12000rpm离心30秒，弃去收集管与废液。
将吸附柱放入一个新的收集管中，加入650μL Wash Buffer，12000rpm离心30秒，倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。
再次用450μL Wash Buffer 漂洗，离心后倒掉废液，将吸附柱重新插入收集管中。
12000rpm开盖离心1分钟。
将DNA吸附柱插入1.5mL离心管，向吸附柱中加入100150μL预热（65℃）Elution Buffer。室温静置5分钟。
大于等于13000rpm离心1分钟洗脱DNA，第一次洗脱通常得到60％70％DNA。
用100μL预热（65℃）Elution Buffer再次洗脱DNA，第二次洗脱可收获另外20％的DNA。
1．2．2 DNA样品质量鉴定
蛋白核酸检测仪快速准确地检出DNA的含量和纯度。纯度以0D260与OD280的比值表
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/650.html
