应用绿色荧光蛋白融合与定点突变技术修正猪链球菌P17基因组
应用绿色荧光蛋白融合与定点突变技术修正猪链球菌P17基因组[20200507220051]
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
关键字:猪链球菌绿色荧光蛋白基因组
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1菌株、质粒2
1.2试剂、培养基 2
1.3方法 3
1.3.1 PCR扩增目的片段与融合PCR3
1.3.2构建并鉴定重组质粒0647：：GFP3
1.3.3碱基定点缺失技术3
1.3.4猪链球菌P1/7感受态的制备4
1.3.5将重组质粒电转化感受态细胞4
1.3.6含重组质粒P1/7筛选与鉴定5
1.3.7 Western Blot确定有效的起始密码子5
2结果5
2.1分析测序数据发现4个基因注解错误5
2.2 SSU0647与GFP融合6
2.3重组质粒0647::GFP的构建与鉴定6
2.4突变质粒0647::GFP-m1和0647::GFP-m2的构建与鉴定7
2.5 Western Blot确定正确的起始密码子7
3讨论 8
致谢8
参考文献8
应用绿色荧光蛋白融合与定点突变技术修正猪链球菌 P1/7基因组
金善宝强化班（动物生产方向） 唐欢宇
引言
猪链球菌（Streptococcus suis）是一种革兰氏阳性菌，在全世界广泛分布，可以引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎及急性死亡[1]，而且还导致生猪从业人员的感染和死亡，是一种重要的人畜共患病原[2,3]。根据荚膜多糖抗原的不同，猪链球菌可分为33个血清型，其中猪链球菌2型（SS2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
）流行最广，从发病动物中分离率最高[2]。猪链球菌病严重影响各国养猪业的发展，尤其是对高密度的养猪场危害更大，为高度集约化猪群的三大主要传染病之一。
1.材料与方法
1.1菌株、质粒
猪链球菌P1/7毒力株分离自患脑膜炎病猪[7]。本实验中猪链球菌在THB（Todd-Hewitt broth,Oxoid）与THA（Todd-Hewitt agar）培养基中培养，培养温度为37℃；大肠杆菌在LB（Luria-Bertani，Becton Dickinson）培养基中培养，培养温度为37℃；在必要情况下，培养基需要加入抗生素。对于猪链球菌，培养基壮观霉素（Spc）浓度为100μg/mL；对于大肠杆菌，培养基Spc浓度为50μg/mL，卡那霉素（Kan）浓度为100 μg/mL；质粒信息见表1。
表1 质粒信息
质粒名称 质粒特性 来源
pEGFP/N2 可编码GFP蛋白 BD Biosciences Clontech
pSET4S 大肠杆菌-猪链球菌穿梭质粒；含lacZ基因； pG + host3复制元件；Spc抗性； 从Dr.Tsutomu Sekizaki Daisuke Takamatsu获得
0647::GFP 以pSET4S为基础构建的重组质粒，其中含有SSU0647与GFP融合片段；Spc抗性 本试验构建
0647::GFP-m1 以0647::GFP质粒为基础，旧“ATG”后的A碱基缺失 本试验构建
0647::GFP-m2 以0647::GFP质粒为基础，新“ATG”后的A碱基缺失 本实验构建
1.2 试剂、培养基
PstI与BamHI两种限制性内切酶、T4连接酶、核酸Marker、酶切产物回收试剂盒等购自Takara公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA bio-tek公司；碱基定点突变试剂盒购自Agilent Technologies公司；GFP单克隆抗体购自TransGen Biotech公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠抗体购自Boster公司；Western blot化学显色试剂盒购自Thermo Scientific公司；其他试剂均为国产分析纯；引物合成由北京鼎国昌盛公司完成；测序由上海桑尼生物科技公司完成；培养基由本实验室配制。
1.3方法
1.3.1 PCR扩增目的片段与融合PCR
分别根据NCBI数据库中猪链球菌毒力株P1/7 SSU0647基因序列、绿色荧光蛋白ORF基因序列用Oligo 6软件设计两对引物。引物序列见表2。其中引物A与B用于扩增长度为239bp的SSU0647片段（从旧起始密码子前200bp直到新起始密码子后30bp），引物C与D用于扩增长度为717bp的GFP片段（去除其起始密码子ATG）。引物A与D 5端分别添加酶切位点PstI与BamHI，引物C 5端需要添加引物B的反向互补序列，以便SSU0647和GFP片段融合。
表2 SSU0647起始密码子片段与GFP片段PCR扩增引物序列
引物名称 引物序列(5-3)
A CTGATCCTGCAGTTAGTTTTTTCAAAAGAGAGT
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
B GCTTGTTCCGCCTGATGTAAT
C ATTACATCAGGCGGAACAAGCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
D GAGTCAGGATCC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
注：划线部分为用于融合的反向互补序列
以P1/7基因组为模板，用引物A和B扩增SSU0647起始密码子区域片段。SSU0647扩增体系为PrimeSTAR Premix 25μL，引物A、B各2.5μL，模板1μL，ddH2O 19μL。扩增条件为98℃ 10s，46.4℃ 15s，72℃ 20s，30个循环；72℃延伸10min。以pEGFP-N2质粒为模板，用引物C和D分别扩增GFP片段。GFP扩增体系为PrimeSTAR Premix 25μL，引物C、D各2.5μL，模板1μL，ddH2O 19μL。扩增条件为98℃ 10s，60.4℃ 15s，72℃ 45s，30个循环，72℃延伸10min。将各目的片段PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段，用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段，置于-20℃保存。
以回收所得到的SSU0647起始密码子区域片段与GFP片段为模板，用引物A和D扩增，使SSU0647起始密码子区域与GFP片段融合，融合片段长度为956bp。融合扩增体系为PrimeSTAR Premix 25μL，引物A、D各2.5μL，模板共1μL，ddH2O 19μL。扩增条件为98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 60s，30个循环，72℃延伸10min。将融合片段经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段，用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段，置于-20℃保存。
1.3.2构建并鉴定重组质粒0647::GFP
以限制性内切酶PstI与BamHI酶切融合PCR产物和质粒pSET4s，反应体系为PstI 1μL，BamHI 1μL，10×Buffer 2μL，DNA 1mg，补ddH2O至20μL反应条件为37℃水浴3h。胶回收酶切后的pSET4s和融合片段，在T4 DNA连接酶的作用下，16℃过夜连接重组质粒。连接产物转化入DH5a感受态细胞，用含有50μg/mL Spc的LB固体培养基筛选阳性重组质粒，采用PCR鉴定阳性质粒。阳性质粒为重组质粒0647::GFP，由上海桑尼生物技术有限公司测序。
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关键字:猪链球菌绿色荧光蛋白基因组
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1菌株、质粒2
1.2试剂、培养基 2
1.3方法 3
1.3.1 PCR扩增目的片段与融合PCR3
1.3.2构建并鉴定重组质粒0647：：GFP3
1.3.3碱基定点缺失技术3
1.3.4猪链球菌P1/7感受态的制备4
1.3.5将重组质粒电转化感受态细胞4
1.3.6含重组质粒P1/7筛选与鉴定5
1.3.7 Western Blot确定有效的起始密码子5
2结果5
2.1分析测序数据发现4个基因注解错误5
2.2 SSU0647与GFP融合6
2.3重组质粒0647::GFP的构建与鉴定6
2.4突变质粒0647::GFP-m1和0647::GFP-m2的构建与鉴定7
2.5 Western Blot确定正确的起始密码子7
3讨论 8
致谢8
参考文献8
应用绿色荧光蛋白融合与定点突变技术修正猪链球菌 P1/7基因组
金善宝强化班（动物生产方向） 唐欢宇
引言
猪链球菌（Streptococcus suis）是一种革兰氏阳性菌，在全世界广泛分布，可以引起猪的急性败血症、脑膜炎、关节炎及急性死亡[1]，而且还导致生猪从业人员的感染和死亡，是一种重要的人畜共患病原[2,3]。根据荚膜多糖抗原的不同，猪链球菌可分为33个血清型，其中猪链球菌2型（SS2 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
）流行最广，从发病动物中分离率最高[2]。猪链球菌病严重影响各国养猪业的发展，尤其是对高密度的养猪场危害更大，为高度集约化猪群的三大主要传染病之一。
1.材料与方法
1.1菌株、质粒
猪链球菌P1/7毒力株分离自患脑膜炎病猪[7]。本实验中猪链球菌在THB（Todd-Hewitt broth,Oxoid）与THA（Todd-Hewitt agar）培养基中培养，培养温度为37℃；大肠杆菌在LB（Luria-Bertani，Becton Dickinson）培养基中培养，培养温度为37℃；在必要情况下，培养基需要加入抗生素。对于猪链球菌，培养基壮观霉素（Spc）浓度为100μg/mL；对于大肠杆菌，培养基Spc浓度为50μg/mL，卡那霉素（Kan）浓度为100 μg/mL；质粒信息见表1。
表1 质粒信息
质粒名称 质粒特性 来源
pEGFP/N2 可编码GFP蛋白 BD Biosciences Clontech
pSET4S 大肠杆菌-猪链球菌穿梭质粒；含lacZ基因； pG + host3复制元件；Spc抗性； 从Dr.Tsutomu Sekizaki Daisuke Takamatsu获得
0647::GFP 以pSET4S为基础构建的重组质粒，其中含有SSU0647与GFP融合片段；Spc抗性 本试验构建
0647::GFP-m1 以0647::GFP质粒为基础，旧“ATG”后的A碱基缺失 本试验构建
0647::GFP-m2 以0647::GFP质粒为基础，新“ATG”后的A碱基缺失 本实验构建
1.2 试剂、培养基
PstI与BamHI两种限制性内切酶、T4连接酶、核酸Marker、酶切产物回收试剂盒等购自Takara公司；质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒购自OMEGA bio-tek公司；碱基定点突变试剂盒购自Agilent Technologies公司；GFP单克隆抗体购自TransGen Biotech公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗鼠抗体购自Boster公司；Western blot化学显色试剂盒购自Thermo Scientific公司；其他试剂均为国产分析纯；引物合成由北京鼎国昌盛公司完成；测序由上海桑尼生物科技公司完成；培养基由本实验室配制。
1.3方法
1.3.1 PCR扩增目的片段与融合PCR
分别根据NCBI数据库中猪链球菌毒力株P1/7 SSU0647基因序列、绿色荧光蛋白ORF基因序列用Oligo 6软件设计两对引物。引物序列见表2。其中引物A与B用于扩增长度为239bp的SSU0647片段（从旧起始密码子前200bp直到新起始密码子后30bp），引物C与D用于扩增长度为717bp的GFP片段（去除其起始密码子ATG）。引物A与D 5端分别添加酶切位点PstI与BamHI，引物C 5端需要添加引物B的反向互补序列，以便SSU0647和GFP片段融合。
表2 SSU0647起始密码子片段与GFP片段PCR扩增引物序列
引物名称 引物序列(5-3)
A CTGATCCTGCAGTTAGTTTTTTCAAAAGAGAGT
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
B GCTTGTTCCGCCTGATGTAAT
C ATTACATCAGGCGGAACAAGCGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
D GAGTCAGGATCC TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC
注：划线部分为用于融合的反向互补序列
以P1/7基因组为模板，用引物A和B扩增SSU0647起始密码子区域片段。SSU0647扩增体系为PrimeSTAR Premix 25μL，引物A、B各2.5μL，模板1μL，ddH2O 19μL。扩增条件为98℃ 10s，46.4℃ 15s，72℃ 20s，30个循环；72℃延伸10min。以pEGFP-N2质粒为模板，用引物C和D分别扩增GFP片段。GFP扩增体系为PrimeSTAR Premix 25μL，引物C、D各2.5μL，模板1μL，ddH2O 19μL。扩增条件为98℃ 10s，60.4℃ 15s，72℃ 45s，30个循环，72℃延伸10min。将各目的片段PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段，用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段，置于-20℃保存。
以回收所得到的SSU0647起始密码子区域片段与GFP片段为模板，用引物A和D扩增，使SSU0647起始密码子区域与GFP片段融合，融合片段长度为956bp。融合扩增体系为PrimeSTAR Premix 25μL，引物A、D各2.5μL，模板共1μL，ddH2O 19μL。扩增条件为98℃ 10s，55℃ 15s，72℃ 60s，30个循环，72℃延伸10min。将融合片段经1%琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下切下目的片段，用OMEGA胶回收试剂盒回收目的片段，置于-20℃保存。
1.3.2构建并鉴定重组质粒0647::GFP
以限制性内切酶PstI与BamHI酶切融合PCR产物和质粒pSET4s，反应体系为PstI 1μL，BamHI 1μL，10×Buffer 2μL，DNA 1mg，补ddH2O至20μL反应条件为37℃水浴3h。胶回收酶切后的pSET4s和融合片段，在T4 DNA连接酶的作用下，16℃过夜连接重组质粒。连接产物转化入DH5a感受态细胞，用含有50μg/mL Spc的LB固体培养基筛选阳性重组质粒，采用PCR鉴定阳性质粒。阳性质粒为重组质粒0647::GFP，由上海桑尼生物技术有限公司测序。
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