MDCK细胞悬浮的研究及其在流感疫苗生产中的应用
MDCK细胞悬浮的研究及其在流感疫苗生产中的应用[20200507184551]
摘要：禽流感作为一种禽类烈性传染病，自1871年首次于意大利报道以来，给全球养禽业带来巨大的损失。同时，禽流感在人类公共卫生学上具有重要的意义也引起了研究者以及大众的关注。MDCK （Madin–Darby canine kidney）细胞在现阶段被认为适合流感病毒的增殖及疫苗的生产。但是MDCK细胞的贴壁性使其在大规模生产上的应用变得非常困难。这篇文章研究了MDCK细胞悬浮生长的工艺。通过逐步降低培养基血清的浓度和在spinner及离心管中筛选，成功使MDCK细胞以单细胞悬浮生长方式在成分已知的培养基中生长。同时，驯化后的MDCK细胞仍然保留较高的唾液酸-α-2,3-半乳糖(SA-α-2,6-Gal)糖链受体的表达，这样驯化产生的MDCK细胞就有了大规模生产禽流感病毒的能力。同时在3L生物反应器上初步摸索了AIV-H9亚型病毒的生产工艺，获得了具有一定效价的病毒。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:禽流感；MDCK细胞；悬浮培养
目录
摘要 I
关键词 I
Abstract II
Keyword II
引 言 1
1 材料与方法 1
1.1 实验材料 1
1.1.1 主要材料 1
1.1.2 主要试剂和仪器设备 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 MDCK细胞静置贴壁培养方法 2
1.2.2 低浓度血清适应及驯化 3
1.2.3 无血清适应及悬浮生长驯化 3
1.2.4 细胞计数及形态观察 4
1.2.5 营养物、代谢物检测及代谢速率计算 4
1.2.6 MDCK细胞膜表面禽流感病毒受体的检测 4
1.2.7 3L反应器中MDCK细胞的单细胞悬浮规模化培养 5
1.2.8 AIV-H9亚型病毒在MDCK细胞上的增殖及MOI的筛选 5
1.2.9 AIV-H9亚型病毒HA效价的检测 5
2 结果与讨论 5
2.1 MDCK细胞驯化适应过程中的细胞形态变化 5
2.2 不同生长条件下MDCK细胞生长性能的比较 6
2.3 适应不同营养条件的MDCK细胞的生长代谢比较 7
2.4 不同生长方式的MDCK细胞表面受体的监测10
2.5 3L反应器上MDCK细胞单细胞自悬浮生长及AIV-H9亚型病毒的增殖比较 10
3 小结 11
参考文献 13
致 谢 14
MDCK单细胞悬浮生长克隆的驯化筛选及其在AIV增殖上的应用
引言
禽流感 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽类烈性传染病，由于其血清型较多，且易发生变异，自1871年首次于意大利报道以来，世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆发和流行[1]，这给国际养禽业造成了巨大的经济损失，而且禽流感在人类公共卫生学上也具有重要意义[2]，从而更加引起了研究人员的高度关注。流感病毒感染机体细胞是由其表面的血凝素蛋白（HA蛋白）与宿主细胞膜表面上的糖链受体唾液酸（Sialic acid，SA）共同介导而完成的，且流感病毒对糖链受体的识别具有特异性[3]。人流感病毒HA蛋白主要识别末端为唾液酸-α-2,6-半乳糖（SA-α-2,6-Gal）的糖链受体，其存在于人呼吸道上皮细胞表面，而禽流感病毒HA蛋白主要识别末端为唾液酸-α-2,3-半乳糖(SA-α-2,6-Gal)的糖链受体，其广泛存在于禽胃肠消化道的上皮细胞表面[4]。在细胞膜上受体的介导下，经过内吞、脱衣壳、复制、转录、翻译、运送、组装、芽殖、释放等一系列生物过程完成子代病毒粒子的增殖。
目前国内的禽流感疫苗生产工艺依然延用几十年前的传统技术，采用SPF鸡胚进行接种增殖。但这种制备方式无疑存在诸多不足之处：1）易污染：鸡胚的质量参差不齐且培养过程中易被外源病原污染，存在生物安全隐患，造成实际防控效果不佳；2）质量低：鸡胚法生产的病毒性疫苗容易造成批次间差异，疫苗质量普遍不高，疫苗中的杂质不能有效去除，实际接种时浪费动物有限的免疫资源；3）成本相对较高：鸡胚的接毒、收毒操作中需要大量人力，生产效率不高，采用SPF鸡胚价格高，随之疫苗成本也会相应提高等等。4)潜在的鸡胚供应风险。一旦禽流感疫情大规模爆发，鸡胚供应将成为疫苗生产的制约瓶颈。所以，采用连续传代细胞替代SPF鸡胚在生物反应器中进行禽流感病毒的大规模增殖制备是目前国内预防兽医科研单位或兽用疫苗生产企业竞相开展的研究热点。
鉴于前文分析，筛选适合AIV体外规模化增殖的连续传代细胞株首先就要筛选具有高丰度SA-α-2,3-Gal糖链受体的动物细胞。据文献报道，能够进行禽流感病毒增殖的动物细胞，如MDCK细胞[5]、Vero细胞[6, 7]、BHK21细胞[8]、HEK293细胞[9]一般都具有前文所述的两种受体，可用于人流感病毒或禽流感病毒的增殖。近几年新型宿主细胞，如人视网膜来源的细胞PER.C6细胞[10]、禽胚胎干细胞EB66[11]等等，也都逐渐被用来进行流感病毒规模化增殖的相关研究。
成熟的动物细胞规模化培养技术依然是采用“细胞工厂”或微载体悬浮培养技术，这种培养技术沿用的是增加细胞粘附生长表面从而增加细胞密度的老方法，操作要求高，工艺繁琐，实际应用有限。目前国外科研单位对动物细胞株进行悬浮生长克隆筛选，获得了能够适应像微生物发酵方式培养的动物细胞悬浮细胞克隆，大大提高了培养密度和产物制备效率，是当今生物医药、兽用医药行业的前沿技术，支撑整个行业的进步。
在本研究中，我们对目前禽流感病毒的增殖宿主MDCK细胞进行单细胞悬浮生长驯化，并筛选出单细胞生长克隆，检测其细胞表面糖链受体变化，并初步增殖AIV-H9亚型病毒，为以后该细胞克隆的实际应用积累实验数据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1主要材料
MDCK细胞株：购自A *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
TCC。
AIV-H9亚型病毒：国家兽用生物制品工程技术研究中心分离、保藏病毒。
1.1.2主要试剂和仪器设备
1.1.2.1 主要试剂
DMEM培养液：购自Gibco公司。
低血清培养液：DMEM固体培养基购自Gibco公司，新生牛血清（Newborn bovine serum，NBS）购自Gibco公司。按操作说明配制.低血清培养基添加物：NaHCO3 2.0 g/L，青霉素100 IU/ml，链霉素100 μg/ml。根据实验需要，加入一定量的血清，配制成含有10%、5%、1%（v/v）血清的DMEM培养液，0.22 μm无菌膜过滤，置于4 ℃冰箱冷藏避光备用。
无血清培养液：以DMEM/F12（1:1）培养基（购自Gibco公司）为基础培养基无血清培养基添加物：大豆蛋白水解物、酵母提取物、转铁蛋白、激素、F-68 等成分（均购自Sigma公司）配制而成，经0.22 μm无菌膜过滤，置于4 °C冰箱冷藏避光备用。
胰蛋白酶购自Invitrogen公司。称取胰蛋白酶0.25 g溶解于100 ml不含Ca2+和Mg2+的D-Hank’s溶液（NaCl 8 g/L、NaHCO3 0.35 g/L、Na2HPO4?H2O 0.06 g/L、KCl 0.4 g/L、KH2PO4 0.06 g/L、酚红 0.02 g/L），配制成0.25%浓度的胰蛋白酶溶液，调整pH值至8.0~9.0，经无菌0.22 μm膜过滤除菌，4 ℃冷藏备用。
台盼蓝染色剂，购自Gibco公司。
标准糖链检测试剂盒，购自Roche公司。
1.1.2.2 主要仪器设备
Applikon3L发酵罐 荷兰Applikon公司
Applikon1L4联发酵罐 荷兰Applikon公司
更换其培养液为含3% NBS的DMEM培养液，使MDCK细胞初步适应低浓度血清的营
摘要：禽流感作为一种禽类烈性传染病，自1871年首次于意大利报道以来，给全球养禽业带来巨大的损失。同时，禽流感在人类公共卫生学上具有重要的意义也引起了研究者以及大众的关注。MDCK （Madin–Darby canine kidney）细胞在现阶段被认为适合流感病毒的增殖及疫苗的生产。但是MDCK细胞的贴壁性使其在大规模生产上的应用变得非常困难。这篇文章研究了MDCK细胞悬浮生长的工艺。通过逐步降低培养基血清的浓度和在spinner及离心管中筛选，成功使MDCK细胞以单细胞悬浮生长方式在成分已知的培养基中生长。同时，驯化后的MDCK细胞仍然保留较高的唾液酸-α-2,3-半乳糖(SA-α-2,6-Gal)糖链受体的表达，这样驯化产生的MDCK细胞就有了大规模生产禽流感病毒的能力。同时在3L生物反应器上初步摸索了AIV-H9亚型病毒的生产工艺，获得了具有一定效价的病毒。
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关键字:禽流感；MDCK细胞；悬浮培养
目录
摘要 I
关键词 I
Abstract II
Keyword II
引 言 1
1 材料与方法 1
1.1 实验材料 1
1.1.1 主要材料 1
1.1.2 主要试剂和仪器设备 2
1.2 实验方法 2
1.2.1 MDCK细胞静置贴壁培养方法 2
1.2.2 低浓度血清适应及驯化 3
1.2.3 无血清适应及悬浮生长驯化 3
1.2.4 细胞计数及形态观察 4
1.2.5 营养物、代谢物检测及代谢速率计算 4
1.2.6 MDCK细胞膜表面禽流感病毒受体的检测 4
1.2.7 3L反应器中MDCK细胞的单细胞悬浮规模化培养 5
1.2.8 AIV-H9亚型病毒在MDCK细胞上的增殖及MOI的筛选 5
1.2.9 AIV-H9亚型病毒HA效价的检测 5
2 结果与讨论 5
2.1 MDCK细胞驯化适应过程中的细胞形态变化 5
2.2 不同生长条件下MDCK细胞生长性能的比较 6
2.3 适应不同营养条件的MDCK细胞的生长代谢比较 7
2.4 不同生长方式的MDCK细胞表面受体的监测10
2.5 3L反应器上MDCK细胞单细胞自悬浮生长及AIV-H9亚型病毒的增殖比较 10
3 小结 11
参考文献 13
致 谢 14
MDCK单细胞悬浮生长克隆的驯化筛选及其在AIV增殖上的应用
引言
禽流感 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
（avian influenza，AI）是由禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）引起的禽类烈性传染病，由于其血清型较多，且易发生变异，自1871年首次于意大利报道以来，世界各地都有特定毒株引起的禽流感爆发和流行[1]，这给国际养禽业造成了巨大的经济损失，而且禽流感在人类公共卫生学上也具有重要意义[2]，从而更加引起了研究人员的高度关注。流感病毒感染机体细胞是由其表面的血凝素蛋白（HA蛋白）与宿主细胞膜表面上的糖链受体唾液酸（Sialic acid，SA）共同介导而完成的，且流感病毒对糖链受体的识别具有特异性[3]。人流感病毒HA蛋白主要识别末端为唾液酸-α-2,6-半乳糖（SA-α-2,6-Gal）的糖链受体，其存在于人呼吸道上皮细胞表面，而禽流感病毒HA蛋白主要识别末端为唾液酸-α-2,3-半乳糖(SA-α-2,6-Gal)的糖链受体，其广泛存在于禽胃肠消化道的上皮细胞表面[4]。在细胞膜上受体的介导下，经过内吞、脱衣壳、复制、转录、翻译、运送、组装、芽殖、释放等一系列生物过程完成子代病毒粒子的增殖。
目前国内的禽流感疫苗生产工艺依然延用几十年前的传统技术，采用SPF鸡胚进行接种增殖。但这种制备方式无疑存在诸多不足之处：1）易污染：鸡胚的质量参差不齐且培养过程中易被外源病原污染，存在生物安全隐患，造成实际防控效果不佳；2）质量低：鸡胚法生产的病毒性疫苗容易造成批次间差异，疫苗质量普遍不高，疫苗中的杂质不能有效去除，实际接种时浪费动物有限的免疫资源；3）成本相对较高：鸡胚的接毒、收毒操作中需要大量人力，生产效率不高，采用SPF鸡胚价格高，随之疫苗成本也会相应提高等等。4)潜在的鸡胚供应风险。一旦禽流感疫情大规模爆发，鸡胚供应将成为疫苗生产的制约瓶颈。所以，采用连续传代细胞替代SPF鸡胚在生物反应器中进行禽流感病毒的大规模增殖制备是目前国内预防兽医科研单位或兽用疫苗生产企业竞相开展的研究热点。
鉴于前文分析，筛选适合AIV体外规模化增殖的连续传代细胞株首先就要筛选具有高丰度SA-α-2,3-Gal糖链受体的动物细胞。据文献报道，能够进行禽流感病毒增殖的动物细胞，如MDCK细胞[5]、Vero细胞[6, 7]、BHK21细胞[8]、HEK293细胞[9]一般都具有前文所述的两种受体，可用于人流感病毒或禽流感病毒的增殖。近几年新型宿主细胞，如人视网膜来源的细胞PER.C6细胞[10]、禽胚胎干细胞EB66[11]等等，也都逐渐被用来进行流感病毒规模化增殖的相关研究。
成熟的动物细胞规模化培养技术依然是采用“细胞工厂”或微载体悬浮培养技术，这种培养技术沿用的是增加细胞粘附生长表面从而增加细胞密度的老方法，操作要求高，工艺繁琐，实际应用有限。目前国外科研单位对动物细胞株进行悬浮生长克隆筛选，获得了能够适应像微生物发酵方式培养的动物细胞悬浮细胞克隆，大大提高了培养密度和产物制备效率，是当今生物医药、兽用医药行业的前沿技术，支撑整个行业的进步。
在本研究中，我们对目前禽流感病毒的增殖宿主MDCK细胞进行单细胞悬浮生长驯化，并筛选出单细胞生长克隆，检测其细胞表面糖链受体变化，并初步增殖AIV-H9亚型病毒，为以后该细胞克隆的实际应用积累实验数据。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1主要材料
MDCK细胞株：购自A *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
TCC。
AIV-H9亚型病毒：国家兽用生物制品工程技术研究中心分离、保藏病毒。
1.1.2主要试剂和仪器设备
1.1.2.1 主要试剂
DMEM培养液：购自Gibco公司。
低血清培养液：DMEM固体培养基购自Gibco公司，新生牛血清（Newborn bovine serum，NBS）购自Gibco公司。按操作说明配制.低血清培养基添加物：NaHCO3 2.0 g/L，青霉素100 IU/ml，链霉素100 μg/ml。根据实验需要，加入一定量的血清，配制成含有10%、5%、1%（v/v）血清的DMEM培养液，0.22 μm无菌膜过滤，置于4 ℃冰箱冷藏避光备用。
无血清培养液：以DMEM/F12（1:1）培养基（购自Gibco公司）为基础培养基无血清培养基添加物：大豆蛋白水解物、酵母提取物、转铁蛋白、激素、F-68 等成分（均购自Sigma公司）配制而成，经0.22 μm无菌膜过滤，置于4 °C冰箱冷藏避光备用。
胰蛋白酶购自Invitrogen公司。称取胰蛋白酶0.25 g溶解于100 ml不含Ca2+和Mg2+的D-Hank’s溶液（NaCl 8 g/L、NaHCO3 0.35 g/L、Na2HPO4?H2O 0.06 g/L、KCl 0.4 g/L、KH2PO4 0.06 g/L、酚红 0.02 g/L），配制成0.25%浓度的胰蛋白酶溶液，调整pH值至8.0~9.0，经无菌0.22 μm膜过滤除菌，4 ℃冷藏备用。
台盼蓝染色剂，购自Gibco公司。
标准糖链检测试剂盒，购自Roche公司。
1.1.2.2 主要仪器设备
Applikon3L发酵罐 荷兰Applikon公司
Applikon1L4联发酵罐 荷兰Applikon公司
更换其培养液为含3% NBS的DMEM培养液，使MDCK细胞初步适应低浓度血清的营
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