湖羊fshr基因3’utr克隆和多态性分析
湖羊是我国南方唯一的绵羊品种，具有早熟、多胎等优良特性。FSHR是哺乳动物卵巢颗粒细胞上重要的膜受体，FSH必须与其结合才能发挥生理作用。本文以FSHR基因为候选基因，采用PCR扩增和测序技术获得湖羊FSHR基因3-UTR序列，运用生物信息学方法分析其序列特征，利用池DNA测序技术筛选湖羊FSHR基因3-UTR中SNPs位点，直接测序分析SNPs位点多态性。结果获得788bp的湖羊FSHR基因3-UTR，序列比对发现其与牛的一致性为92.99%，且含有加尾信号和保守的ARE元件等；池DNA测序在终止密码子325nt处发现一个碱基T插入/缺失，命名为*325delT；直接测序在湖羊和巴什拜羊群体FSHR基因*325delT位点发现3种基因型（TT、T-和--）；在湖羊群体中，T为优势等位基因，等位基因频率为0.604，而在巴什拜羊群体中，-为优势等位基因，等位基因频率为0.635。研究结果表明湖羊FSHR基因*325delT的多态性可能与其繁殖性能有关。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验动物 2
1.2主要试剂2
1.3实验仪器2
1.4实验方法2
1.4.1基因组DNA提取2
1.4.2引物的设计与合成2
1.4.3 PCR扩增3
1.4.4凝胶电泳及回收 3
1.4.5测序3
1.4.6序列分析3
1.4.7 SNPs筛选与分析3
1.4.8统计分析3
2结果与分析3
2.1湖羊基因组DNA提取3
2.2湖羊FSHR基因3UTR序列扩增4
2.3湖羊FSHR基因3UTR序列分析4
2.4湖羊FSHR基因3UTR序列SNP筛选6
2.5湖羊FSHR基因*325delT位点多态性分析6
2.6湖羊FSHR基因*325delT位点遗传多样性7
3讨论7
致谢8
参考文献9
附录10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
图1湖羊基因组DNA电泳图谱4
图2湖羊FSHR基因扩增产物电泳图谱4
图3湖羊FSHR基因3UTR序列5
图4湖羊FSHR基因3UTR序列与人、牛、猪同源性对比5
图5湖羊FSHR基因*325delT位点测序峰图6
图6湖羊FSHR基因*325delT位点不同基因型个体测序结果6
表1引物相关信息3
表2湖羊和巴氏拜羊FSHR基因*325delT位点基因型频率和等位基因率7
表3湖羊和巴氏拜羊FSHR基因*325delT位点遗传多态性指标7
湖羊FSHR基因3UTR克隆和多态性分析
引言
促卵泡素（Follicle stimulating hormone，FSH）是一种糖蛋白激素，其作用于卵巢可调节雌性动物的卵泡生长和排卵过程，对雌性动物的生殖调控有重要的影响。但FSH为大分子结构，无法直接透过细胞膜来传递信号，需要与其受体即促卵泡素受体（Follicle stimulating hormone receptor，FSHR）结合，引起G蛋白偶联反应的发生，从而激活腺苷酸环化酶的活性，使ATP转化cAMP，进而激活依赖cAMP的蛋白激酶的活性，合成相应的mRNA，形成新的功能蛋白，发挥其生理作用[1]。近年来的研究表明，FSHR对颗粒细胞的增殖，分化和凋亡中也有一定的影响，是影响哺乳动物高繁殖力性状的主效基因之一。众多研究表明，雌性动物FSHR基因多态性与其繁殖性状存在一定关系。在荷斯坦奶牛中，Cory等[2]对FSHR基因编码区10个外显子进行检测，结果发现了7个SNP位点，其中3个是非同义突变，会导致氨基酸结构改变，超排试验证明其可影响母畜排卵数及胚胎活性。谢新华等[3]检测了太湖猪和商品猪FSHR基因5调控区的SNP位点，在梅山猪群的5调控区发现两个SNP位点，在对不同猪种的FSHR基因5调控区的多态性与卵巢组织FSHR基因表达水平进行了关联分析表明，FSHR基因5调控区A/G突变可能影响FSHR基因mRNA的表达，从而影响猪卵泡发育和繁殖。Zhang等[4]对皖南黑猪和伯克希尔猪FSHR基因编码区变异和产仔数关联研究发现，在编码区第10外显子中发现3个SNP位点，且与产仔性状显著关联。在中国地方山羊品种中，王玉金等[5]、孟丽娜等[6]研究发现，FSHR编码区存在多个SNP位点，且与产仔性状显著关联。在绵羊中，Pan等[7]对湖羊FSHR基因多态性和产羔数关联分析研究中发现在其5调控区存在C/T突变，且不同基因型间的产羔数存在显著差异。
湖羊是我国具有多胎优良性状的绵羊品种，寻找多胎主效基因一直是湖羊多胎分子机制领域的研究热点，FSHR就是一个重要的候选基因[8]。目前关于湖羊FSHR基因多态性的研究主要集中在编码区和5调控区[7]，其3UTR及其多态性的研究还未见报道。本文以FSHR基因为候选基因，采用PCR扩增和测序技术获得湖羊FSHR基因3UTR序列，运用生物信息学方法分析其序列特征，利用池DNA测序技术筛选湖羊FSHR基因3UTR中SNPs位点，直接测序分析湖羊和巴什拜羊（对照）SNPs位点多态性，为揭示FSHR基因多态性与湖羊高繁殖力的关系提供可靠依据。
1 材料与方法
1.1实验动物
在苏州市种羊场选择健康无病、体况良好、经产湖羊母羊，采集耳组织样，用于基因组DNA的提取。巴什拜羊耳组织样采自新疆裕民县。
1.2主要试剂
（1）PCR：rTaq DNA聚合酶（TaKaRa公司），SYBR Premix EX TaqTM HS DNA聚合酶（内含TaKaRa Ex TaqTM HS，dNTP Mixture，Mg2+，SYBR GreenⅠ等）（TaKaRa公司），石蜡油（上海锦海特种润滑油厂）；
（2）电泳：Tris Base，Na2EDTA2H2O，硼酸，丙烯酰胺，N，N亚甲基双丙烯酰胺，过硫酸铵（APS，四甲基乙二胺TEMED），6×Loading Buffer，无水乙醇，乙酸，硝酸银，甲醛，氢氧化钠，琼脂糖，溴化乙锭（TBE，10mg/mL）；
（3）胶回收：AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒，购自美国Axygen公司。
1.3实验仪器
可调式微量移液器：德国Eppendorf 公司
超低温冰箱：美国Thermo公司
梯度PCR仪：日本TaKaRa公司
低温高速离心机（Centrifuge 5810R）：德国Eppendorf公司
DYYIII2稳压电泳仪：北京六一仪器厂
电泳凝胶成像系统：美国BIORAD 公司
微波炉：格兰仕
4实验方法
1.4.1基因组DNA提取
利用常规的酚氯仿抽提法提法提取湖羊基因组DNA，溶于超纯水中，并于20 ℃保存。具体实验操作方法见附录。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验动物 2
1.2主要试剂2
1.3实验仪器2
1.4实验方法2
1.4.1基因组DNA提取2
1.4.2引物的设计与合成2
1.4.3 PCR扩增3
1.4.4凝胶电泳及回收 3
1.4.5测序3
1.4.6序列分析3
1.4.7 SNPs筛选与分析3
1.4.8统计分析3
2结果与分析3
2.1湖羊基因组DNA提取3
2.2湖羊FSHR基因3UTR序列扩增4
2.3湖羊FSHR基因3UTR序列分析4
2.4湖羊FSHR基因3UTR序列SNP筛选6
2.5湖羊FSHR基因*325delT位点多态性分析6
2.6湖羊FSHR基因*325delT位点遗传多样性7
3讨论7
致谢8
参考文献9
附录10
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
图1湖羊基因组DNA电泳图谱4
图2湖羊FSHR基因扩增产物电泳图谱4
图3湖羊FSHR基因3UTR序列5
图4湖羊FSHR基因3UTR序列与人、牛、猪同源性对比5
图5湖羊FSHR基因*325delT位点测序峰图6
图6湖羊FSHR基因*325delT位点不同基因型个体测序结果6
表1引物相关信息3
表2湖羊和巴氏拜羊FSHR基因*325delT位点基因型频率和等位基因率7
表3湖羊和巴氏拜羊FSHR基因*325delT位点遗传多态性指标7
湖羊FSHR基因3UTR克隆和多态性分析
引言
促卵泡素（Follicle stimulating hormone，FSH）是一种糖蛋白激素，其作用于卵巢可调节雌性动物的卵泡生长和排卵过程，对雌性动物的生殖调控有重要的影响。但FSH为大分子结构，无法直接透过细胞膜来传递信号，需要与其受体即促卵泡素受体（Follicle stimulating hormone receptor，FSHR）结合，引起G蛋白偶联反应的发生，从而激活腺苷酸环化酶的活性，使ATP转化cAMP，进而激活依赖cAMP的蛋白激酶的活性，合成相应的mRNA，形成新的功能蛋白，发挥其生理作用[1]。近年来的研究表明，FSHR对颗粒细胞的增殖，分化和凋亡中也有一定的影响，是影响哺乳动物高繁殖力性状的主效基因之一。众多研究表明，雌性动物FSHR基因多态性与其繁殖性状存在一定关系。在荷斯坦奶牛中，Cory等[2]对FSHR基因编码区10个外显子进行检测，结果发现了7个SNP位点，其中3个是非同义突变，会导致氨基酸结构改变，超排试验证明其可影响母畜排卵数及胚胎活性。谢新华等[3]检测了太湖猪和商品猪FSHR基因5调控区的SNP位点，在梅山猪群的5调控区发现两个SNP位点，在对不同猪种的FSHR基因5调控区的多态性与卵巢组织FSHR基因表达水平进行了关联分析表明，FSHR基因5调控区A/G突变可能影响FSHR基因mRNA的表达，从而影响猪卵泡发育和繁殖。Zhang等[4]对皖南黑猪和伯克希尔猪FSHR基因编码区变异和产仔数关联研究发现，在编码区第10外显子中发现3个SNP位点，且与产仔性状显著关联。在中国地方山羊品种中，王玉金等[5]、孟丽娜等[6]研究发现，FSHR编码区存在多个SNP位点，且与产仔性状显著关联。在绵羊中，Pan等[7]对湖羊FSHR基因多态性和产羔数关联分析研究中发现在其5调控区存在C/T突变，且不同基因型间的产羔数存在显著差异。
湖羊是我国具有多胎优良性状的绵羊品种，寻找多胎主效基因一直是湖羊多胎分子机制领域的研究热点，FSHR就是一个重要的候选基因[8]。目前关于湖羊FSHR基因多态性的研究主要集中在编码区和5调控区[7]，其3UTR及其多态性的研究还未见报道。本文以FSHR基因为候选基因，采用PCR扩增和测序技术获得湖羊FSHR基因3UTR序列，运用生物信息学方法分析其序列特征，利用池DNA测序技术筛选湖羊FSHR基因3UTR中SNPs位点，直接测序分析湖羊和巴什拜羊（对照）SNPs位点多态性，为揭示FSHR基因多态性与湖羊高繁殖力的关系提供可靠依据。
1 材料与方法
1.1实验动物
在苏州市种羊场选择健康无病、体况良好、经产湖羊母羊，采集耳组织样，用于基因组DNA的提取。巴什拜羊耳组织样采自新疆裕民县。
1.2主要试剂
（1）PCR：rTaq DNA聚合酶（TaKaRa公司），SYBR Premix EX TaqTM HS DNA聚合酶（内含TaKaRa Ex TaqTM HS，dNTP Mixture，Mg2+，SYBR GreenⅠ等）（TaKaRa公司），石蜡油（上海锦海特种润滑油厂）；
（2）电泳：Tris Base，Na2EDTA2H2O，硼酸，丙烯酰胺，N，N亚甲基双丙烯酰胺，过硫酸铵（APS，四甲基乙二胺TEMED），6×Loading Buffer，无水乙醇，乙酸，硝酸银，甲醛，氢氧化钠，琼脂糖，溴化乙锭（TBE，10mg/mL）；
（3）胶回收：AxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒，购自美国Axygen公司。
1.3实验仪器
可调式微量移液器：德国Eppendorf 公司
超低温冰箱：美国Thermo公司
梯度PCR仪：日本TaKaRa公司
低温高速离心机（Centrifuge 5810R）：德国Eppendorf公司
DYYIII2稳压电泳仪：北京六一仪器厂
电泳凝胶成像系统：美国BIORAD 公司
微波炉：格兰仕
4实验方法
1.4.1基因组DNA提取
利用常规的酚氯仿抽提法提法提取湖羊基因组DNA，溶于超纯水中，并于20 ℃保存。具体实验操作方法见附录。
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