不同方法检测猪O型口蹄疫免疫抗体的对比试验
不同方法检测猪O型口蹄疫免疫抗体的对比试验[20200507185907]
摘要：为了评价猪O型口蹄疫抗体不同检测方法的相关性和特点，应用正向间接血凝试验（IHA）与液相阻断酶联免疫吸附试验（LPB-ELISA）方法对90 份猪血清样本进行猪O型口蹄疫免疫抗体检测。IHA 试验检测合格69份，合格率为72.3﹪；LPB-ELISA 检测合格60份，合格率为66.7﹪。试验结果表明，IHA 方法检测口蹄疫O 型免疫抗体合格率比LPB-ELISA 方法高，两者符合率为87.8%，Kappa 值=0.714，两者一致性强度为好。
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关键字:口蹄疫；正向间接血凝试验；液相阻断酶联免疫吸附试验；抗体水平
目录
摘要 2
关键词 2
Abstract? 2
Key words 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 试验材料 3
1.1.2 试验试剂 3
1.1.3 器材准备 3
1.2 试验方法 3
1.2.1 正向间接血凝试验（IHA）方法 3
1.2.2 液相阻断酶联免疫吸附试验（LPB-ELISA）方法 4
1.3 数据分析 4
2 结果 4
3 分析与讨论 5
致谢 6
参考文献 7
不同方法检测猪O型口蹄疫免疫抗体的对比试验
引言
口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由具有抗原易变性、血清多样性的口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高接触性传染病[1]。其传播速度快，往往造成大流行，由于难于防治、补救措施少，对养殖业构成严重威胁，严重影响国内、国际贸易，造成巨大的经济损失。世界卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病，我国规定为一类传染病，并将其列为强制免疫的重大动物疫病之一[2-3]。
免疫抗体效价检测不仅能够评价免疫效果，也是制定合理免疫程序的主要依据。但是在免疫抗体效价检测中，其检测方法有很多，因受其疫苗种类、检测方法、试剂的不同而检测结果常有差异。同一份样品在不同的地方检测结果不一致的现象也时有发生，因此选择科学合理的检测方法是进行科学评估的基础[4]。常用的口蹄疫免疫抗体检测方法包括正向间接血凝试验（IHA）和液相阻断酶联免疫吸附试验（LPB-ELISA）。本试验分别采用IHA 和LPB-ELISA 两种方法对90 份猪血 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
清样品进行猪口蹄疫O 型免疫抗体效价的对比试验，为实际工作中选择科学合理的检测方法提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料
血清样本来源于严格按照国家政策进行口蹄疫免疫的规模猪场，共90份。
包被缓冲液（pH9.6）：将碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开，将胶囊内粉末倒入100mL无离子水中溶解,4℃存放。磷酸盐-吐温缓冲液（PBST）：将25倍PBST浓缩液用无离子水稀释成1倍PBST。底物溶液：取1片柠檬酸-磷酸盐片剂溶于100mL无离子水中，溶化后，取50mL本溶液，再加1片邻苯二胺（OPD）片剂，充分溶解，分装，避光－20℃保存。
1.1.2 试验试剂
口蹄疫O型血凝抗原、口蹄疫O型阳性对照血清、口蹄疫O型阴性对照血清、稀释液，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号为2014022804。口蹄疫O型病毒抗原、口蹄疫O型病毒兔抗血清、口蹄疫O型病毒豚鼠抗血清、兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物、口蹄疫O型阳性对照血清、口蹄疫阴性对照血清、3％双氧水、豚鼠抗血清稀释液、终止液等，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号为2014040101。
1.1.3 器材准备
96孔110°V型医用血凝板、96孔酶标板、U型96孔抗原反应板、移液器、移液枪尖、液体加样槽等。
1.2 试验方法
1.2.1 正向间接血凝试验（IHA）方法
在血凝板上1～7排的1～10孔、第8排的1～4孔和第5～7孔，加稀释液50μL／孔。待检血清使用前，需经过56℃水浴灭活30分钟，取待检灭活血清样品50μL，分别加入反应板1～6排的第1孔中，与稀释液混匀后，吸取50μL，加于第2孔中，依次作2倍系列稀释至第10孔，第10孔混匀后取出50μL弃去。在血凝板的第7排第一孔加阳性血清50μL,2倍系列稀释至第10孔，混匀后该孔取出50μL丢弃。此时被检血清和阳性血清的稀释倍数依次为1：2～1:1024。在血凝板的第8排第1孔加阴性血清50μL，对倍稀释至第4孔，混匀后从第4孔中取出50μL弃去。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2、1：4、1:8、1:16。第5～7孔为稀释液对照，每孔仅加50μL稀释液。然后在血清稀释孔和稀释对照孔加血凝抗原25μL／孔。将反应板置微型振荡器上振荡2～3分钟，至血球分布均匀。封板膜封板，室温下静置2～3小时判定结果。
结果观察阴性对照血清1∶16孔，稀释液对照，均应无凝集( 红细胞全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点)或仅出现“+”凝集(红细胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圆点);阳性血清对照1：2 ～ 1∶256 各孔从“+ + ”凝集变为“+ + +”凝集为合格(红细胞在孔底形成一层薄膜，面积略小)，在对照孔合格的前提下，观察待测血清各孔，以呈现“+ +”血凝反应的血清最高稀释度作为间接血凝抗体效价，结果以抗体效价≧1:32为免疫合格。
1.2.2 液相阻断酶联免疫吸附试验（LPB-ELISA）方法
用包被缓冲液稀释口蹄疫O型兔抗血清至工作浓度（1:1000），在酶标板上加50μL／孔，振荡，封板，室温过夜。在96孔血清／病毒抗原反应板上，以50μL／孔的量用PBST两倍连续稀释被检血清，从1:4至1:5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
12。同时稀释阳性对照血清，从1:8～1:1024；稀释阴性对照血清，从1:2～1:4；将病毒抗原用PBST稀释至工作浓度，以50μL／孔的量加入被检血清、阴阳性对照血清的每一稀释孔内，4孔病毒抗原对照孔仅加入100μL／孔稀释至工作浓度的病毒抗原，振荡，2～8℃过夜。加入等量的病毒抗原后，血清的稀释度加倍，变为1:8～1:1024。用PBST连续洗酶标板5次，在水洗纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至酶标板上的相对应孔，50μL／孔，封板，37℃温育60分钟。接下来同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释口蹄疫O型病毒豚鼠抗血清至工作浓度（1:1000），加50μL／孔，封板，37℃温育60分钟后，同上洗板5次，甩干。用PBST稀释兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度（1:500），加50μL／孔，封板，37℃温育60分钟。最后同上洗板5次，加50μL／孔底物溶液（底物溶液务必要加双氧水，每1mL加10μL3﹪双氧水），37℃温育15分钟。每孔再加50μL终止液终止反应，读取D492nm值。
病毒抗原对照D492nm值应在1.5±0.5范围内。阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜1:8。在对照孔合格的前提下，弃去抗原对照孔最高和最低D492nm值，计算剩余2孔的平均D492nm值，再除以2，即50﹪对照值。以病毒抗原对照平均D492nm值的50﹪为临界值，被检血清D492nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔，阳性孔的最高稀释倍数为被检血清的抗体效价。抗体效价≥1:64，判定为抗体合格。
摘要：为了评价猪O型口蹄疫抗体不同检测方法的相关性和特点，应用正向间接血凝试验（IHA）与液相阻断酶联免疫吸附试验（LPB-ELISA）方法对90 份猪血清样本进行猪O型口蹄疫免疫抗体检测。IHA 试验检测合格69份，合格率为72.3﹪；LPB-ELISA 检测合格60份，合格率为66.7﹪。试验结果表明，IHA 方法检测口蹄疫O 型免疫抗体合格率比LPB-ELISA 方法高，两者符合率为87.8%，Kappa 值=0.714，两者一致性强度为好。
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关键字:口蹄疫；正向间接血凝试验；液相阻断酶联免疫吸附试验；抗体水平
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Abstract? 2
Key words 2
1 材料与方法 3
1.1 材料 3
1.1.1 试验材料 3
1.1.2 试验试剂 3
1.1.3 器材准备 3
1.2 试验方法 3
1.2.1 正向间接血凝试验（IHA）方法 3
1.2.2 液相阻断酶联免疫吸附试验（LPB-ELISA）方法 4
1.3 数据分析 4
2 结果 4
3 分析与讨论 5
致谢 6
参考文献 7
不同方法检测猪O型口蹄疫免疫抗体的对比试验
引言
口蹄疫（foot and mouth disease，FMD）是由具有抗原易变性、血清多样性的口蹄疫病毒引起的一种急性、热性、高接触性传染病[1]。其传播速度快，往往造成大流行，由于难于防治、补救措施少，对养殖业构成严重威胁，严重影响国内、国际贸易，造成巨大的经济损失。世界卫生组织（OIE）将其列为必须报告的动物传染病，我国规定为一类传染病，并将其列为强制免疫的重大动物疫病之一[2-3]。
免疫抗体效价检测不仅能够评价免疫效果，也是制定合理免疫程序的主要依据。但是在免疫抗体效价检测中，其检测方法有很多，因受其疫苗种类、检测方法、试剂的不同而检测结果常有差异。同一份样品在不同的地方检测结果不一致的现象也时有发生，因此选择科学合理的检测方法是进行科学评估的基础[4]。常用的口蹄疫免疫抗体检测方法包括正向间接血凝试验（IHA）和液相阻断酶联免疫吸附试验（LPB-ELISA）。本试验分别采用IHA 和LPB-ELISA 两种方法对90 份猪血 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
清样品进行猪口蹄疫O 型免疫抗体效价的对比试验，为实际工作中选择科学合理的检测方法提供参考依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试验材料
血清样本来源于严格按照国家政策进行口蹄疫免疫的规模猪场，共90份。
包被缓冲液（pH9.6）：将碳酸盐缓冲液胶囊1粒小心打开，将胶囊内粉末倒入100mL无离子水中溶解,4℃存放。磷酸盐-吐温缓冲液（PBST）：将25倍PBST浓缩液用无离子水稀释成1倍PBST。底物溶液：取1片柠檬酸-磷酸盐片剂溶于100mL无离子水中，溶化后，取50mL本溶液，再加1片邻苯二胺（OPD）片剂，充分溶解，分装，避光－20℃保存。
1.1.2 试验试剂
口蹄疫O型血凝抗原、口蹄疫O型阳性对照血清、口蹄疫O型阴性对照血清、稀释液，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号为2014022804。口蹄疫O型病毒抗原、口蹄疫O型病毒兔抗血清、口蹄疫O型病毒豚鼠抗血清、兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物、口蹄疫O型阳性对照血清、口蹄疫阴性对照血清、3％双氧水、豚鼠抗血清稀释液、终止液等，由中国农业科学院兰州兽医研究所生产，批号为2014040101。
1.1.3 器材准备
96孔110°V型医用血凝板、96孔酶标板、U型96孔抗原反应板、移液器、移液枪尖、液体加样槽等。
1.2 试验方法
1.2.1 正向间接血凝试验（IHA）方法
在血凝板上1～7排的1～10孔、第8排的1～4孔和第5～7孔，加稀释液50μL／孔。待检血清使用前，需经过56℃水浴灭活30分钟，取待检灭活血清样品50μL，分别加入反应板1～6排的第1孔中，与稀释液混匀后，吸取50μL，加于第2孔中，依次作2倍系列稀释至第10孔，第10孔混匀后取出50μL弃去。在血凝板的第7排第一孔加阳性血清50μL,2倍系列稀释至第10孔，混匀后该孔取出50μL丢弃。此时被检血清和阳性血清的稀释倍数依次为1：2～1:1024。在血凝板的第8排第1孔加阴性血清50μL，对倍稀释至第4孔，混匀后从第4孔中取出50μL弃去。此时阴性血清的稀释倍数依次为1:2、1：4、1:8、1:16。第5～7孔为稀释液对照，每孔仅加50μL稀释液。然后在血清稀释孔和稀释对照孔加血凝抗原25μL／孔。将反应板置微型振荡器上振荡2～3分钟，至血球分布均匀。封板膜封板，室温下静置2～3小时判定结果。
结果观察阴性对照血清1∶16孔，稀释液对照，均应无凝集( 红细胞全部沉入孔底形成边缘整齐的小圆点)或仅出现“+”凝集(红细胞在孔底呈稀薄、散在、少量凝集，孔底有小圆点);阳性血清对照1：2 ～ 1∶256 各孔从“+ + ”凝集变为“+ + +”凝集为合格(红细胞在孔底形成一层薄膜，面积略小)，在对照孔合格的前提下，观察待测血清各孔，以呈现“+ +”血凝反应的血清最高稀释度作为间接血凝抗体效价，结果以抗体效价≧1:32为免疫合格。
1.2.2 液相阻断酶联免疫吸附试验（LPB-ELISA）方法
用包被缓冲液稀释口蹄疫O型兔抗血清至工作浓度（1:1000），在酶标板上加50μL／孔，振荡，封板，室温过夜。在96孔血清／病毒抗原反应板上，以50μL／孔的量用PBST两倍连续稀释被检血清，从1:4至1:5 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
12。同时稀释阳性对照血清，从1:8～1:1024；稀释阴性对照血清，从1:2～1:4；将病毒抗原用PBST稀释至工作浓度，以50μL／孔的量加入被检血清、阴阳性对照血清的每一稀释孔内，4孔病毒抗原对照孔仅加入100μL／孔稀释至工作浓度的病毒抗原，振荡，2～8℃过夜。加入等量的病毒抗原后，血清的稀释度加倍，变为1:8～1:1024。用PBST连续洗酶标板5次，在水洗纸上甩干，再将抗原抗体混合物从抗原抗体反应板上按次序转移至酶标板上的相对应孔，50μL／孔，封板，37℃温育60分钟。接下来同上洗板5次，甩干。用豚鼠抗血清稀释液稀释口蹄疫O型病毒豚鼠抗血清至工作浓度（1:1000），加50μL／孔，封板，37℃温育60分钟后，同上洗板5次，甩干。用PBST稀释兔抗豚鼠血清IgG-辣根过氧化物酶结合物至工作浓度（1:500），加50μL／孔，封板，37℃温育60分钟。最后同上洗板5次，加50μL／孔底物溶液（底物溶液务必要加双氧水，每1mL加10μL3﹪双氧水），37℃温育15分钟。每孔再加50μL终止液终止反应，读取D492nm值。
病毒抗原对照D492nm值应在1.5±0.5范围内。阳性对照抗体效价应在1:1024±1滴度以内，阴性对照血清抗体效价应＜1:8。在对照孔合格的前提下，弃去抗原对照孔最高和最低D492nm值，计算剩余2孔的平均D492nm值，再除以2，即50﹪对照值。以病毒抗原对照平均D492nm值的50﹪为临界值，被检血清D492nm值大于临界值的孔为阴性孔，小于等于临界值的孔为阳性孔，阳性孔的最高稀释倍数为被检血清的抗体效价。抗体效价≥1:64，判定为抗体合格。
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