临床常见羊呼吸道疾病的病原学检测与分析
：呼吸道疾病是危害牛羊养殖业的重要疾病，病因复杂多样，其中传染性疾病多由细菌和病毒感染引起。羊呼吸道疾病多是由支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌、山羊副流感病毒3型(CPIV3)、小反刍兽疫等病原的单独或混合感染造成的。本研究通过对从江苏省主要养羊地区采集的106份鼻腔棉拭子和血清样本以及15份病变组织（肺、肝）进行病原学检测，结果如下：18份检测到绵羊肺炎支原体，6份检测出CPIV3，2份检出小反刍兽疫，溶血性曼氏杆菌3份（3/15），大肠杆菌9份（9/15）。检测结果表明：支原体是引起江苏地区羊呼吸道疾病的主要病原，个别存在多种病原的混合感染。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1试剂 2
1.2 方法 2
1.2.1临床症状与病理变化观察2
1.2.2提取RNA2
1.2.3提取DNA2
1.2.4病原检测3
2结果与分析4
2.1临床症状与病理变化4
2.2病原检测结果4
2.2.1副流感检测的PCR结果4
2.2.2支原体检测的PCR结果4
2.2.3小反刍兽疫检测的PCR结果5
2.2.4细菌分离鉴定结果5
3讨论 6
3.1本实验的研究意义6
3.2本实验的结果分析6
3.2.1副流感3型检测结果分析7
3.2.2支原体检测结果分析7
3.2.3小反刍兽疫检测结果分析7
3.2.4细菌检测结果分析7
致谢7
参考文献8
临床常见羊呼吸道疾病的病原学检测与分析
引言
羊呼吸道疾病多是由支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌、山羊副流感病毒3型(CPIV3)、小反刍兽疫等病原的单独或混合感染造成的。羊呼吸道疾病可发生于牛羊生长的各个阶段，属于常见的地方性动物疾病，尤其在秋、冬、春季极易发生。该病主要病理表现为精神沉郁，食欲废
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
绝，呼吸困难，流黏性鼻液，营养不良，消瘦，精神沉郁，腹式呼吸，喘气，有时颈部和胸下出现水肿。该病不仅影响羊的正常生理活动，而且严重时会造成羊的死亡，危害严重。因此，防治羊呼吸道疾病，降低其发病率是加快羊业发展，提高养殖效益的必由之路。[1]引起羊呼吸道疾病的病原具有其多样性，不能简单地一概而论。对发病羊进行病原性检测，找出病因，是防治羊呼吸道疾病的先决条件，因此我们对地江苏省部分养羊地区出现呼吸道症状的羊及送检的发病羊进行进行系统的病原学检测，并对检测结果进行了分析，现报告如下。
1 材料和方法
1．1 试剂
1.1.1 支原体、山羊副流感病毒3型、小反刍兽疫阳性参照物
由江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室李文良博士保存。
1.1.2 各种试剂
由江苏TranszolUP试剂、一步法PTPCR试剂盒、Taq酶、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；TSA、TSB、麦康凯均购自原北京陆桥技术有限责任公司； 微量生化反应管及药敏试纸均购自原杭州天和微生物制剂有限公司。.
1.1.3 引物
参考已发表的文献：副流感 MF1（AGTGATCTAGATGATGATCCA）/MR1(GTTATTGATCCAATTGCTGT)[2]、小反刍兽疫 PPRVNF(ATTGTCCACTATTGAATCCTTGAT)/PPRVNR(TTGTCGTTGTAGACCTGACTGTTG)[3]、支原体MmF（5’CGAAAGCGGCTTACTGGCTTGTT3’）/MmR(5’TTGAGATTAGCTCCCCTTCACAG3’)。[4]
1.1.4 电泳缓冲液（TAE）试剂
50×TAE Buffer 配制方法：
1.称量氨基丁三醇?242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L烧杯中；
2.向烧杯中加入约600ml去离子水，充分搅拌均匀；
3.加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；
4.用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。
使用时稀释50倍 即1×TAE Buffer。
1.1.5 主要仪器
PCR仪：AmpGene公司生产，DNAThermol Cycler4800 型；低温台式高速离心机购自Beckman公司；YY2Ⅲ8B稳压稳流电泳仪购自北京六一仪器厂;721BR09310 型凝胶成像系统购自BioRad公司;CO2培养箱购自ThermoForma公司;兔血琼脂平板由广西兽医研究所细菌研究室制备。
1．2 方法
1.2.1 临床症状与病理变化观察
现场了解发病经过，剖解病死羊，肉眼观察各脏器形态变化并记录。
1.2.2 提取RNA
取血清样品和鼻拭子样品200μL，加入1mL TranszolUP,按照说明书提取总RNA,最终溶于无RNase水中。
1.2.3 提取DNA
DNA采取常规酚氯仿抽提法提取。
1.1ml的全血/新鲜组织加入1ml的灭菌水，颠倒混匀（新鲜组织需碾磨），5000转离 心10分钟，弃上清。管底应该有沉淀。重复两次。
2.取250ul的上述液体加入50ul的DNA裂解液，5ul的蛋白酶K混匀。
3.54度水浴30分钟。
4.消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液（1:1），剧烈震荡，使其变成奶咖色。
5.12000转离心5分钟。
6.取上清480ul，注意不要洗到中间介质以及下层液体。
7.加入等体积的氯仿，颠倒混匀。
8.12000转离心5分钟。
9.取上清400ul，注意不要洗到中间介质以及下层液体。
10.加入10分之一的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀。
11.放入冰箱静置过夜。
12.取出后12000转离心15分钟，弃上清，倒置。
13.加入500ul 无水乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次。
14.12000转离心5分钟。
15.弃上清，然后室温开盖静置分钟使其乙醇挥发干净。
16.加入灭菌水溶解DNA，一般加入20ul灭菌水溶解。
1.2.4 病原检测
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1 材料与方法2
1.1试剂 2
1.2 方法 2
1.2.1临床症状与病理变化观察2
1.2.2提取RNA2
1.2.3提取DNA2
1.2.4病原检测3
2结果与分析4
2.1临床症状与病理变化4
2.2病原检测结果4
2.2.1副流感检测的PCR结果4
2.2.2支原体检测的PCR结果4
2.2.3小反刍兽疫检测的PCR结果5
2.2.4细菌分离鉴定结果5
3讨论 6
3.1本实验的研究意义6
3.2本实验的结果分析6
3.2.1副流感3型检测结果分析7
3.2.2支原体检测结果分析7
3.2.3小反刍兽疫检测结果分析7
3.2.4细菌检测结果分析7
致谢7
参考文献8
临床常见羊呼吸道疾病的病原学检测与分析
引言
羊呼吸道疾病多是由支原体、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、大肠杆菌、山羊副流感病毒3型(CPIV3)、小反刍兽疫等病原的单独或混合感染造成的。羊呼吸道疾病可发生于牛羊生长的各个阶段，属于常见的地方性动物疾病，尤其在秋、冬、春季极易发生。该病主要病理表现为精神沉郁，食欲废
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
绝，呼吸困难，流黏性鼻液，营养不良，消瘦，精神沉郁，腹式呼吸，喘气，有时颈部和胸下出现水肿。该病不仅影响羊的正常生理活动，而且严重时会造成羊的死亡，危害严重。因此，防治羊呼吸道疾病，降低其发病率是加快羊业发展，提高养殖效益的必由之路。[1]引起羊呼吸道疾病的病原具有其多样性，不能简单地一概而论。对发病羊进行病原性检测，找出病因，是防治羊呼吸道疾病的先决条件，因此我们对地江苏省部分养羊地区出现呼吸道症状的羊及送检的发病羊进行进行系统的病原学检测，并对检测结果进行了分析，现报告如下。
1 材料和方法
1．1 试剂
1.1.1 支原体、山羊副流感病毒3型、小反刍兽疫阳性参照物
由江苏省农业科学院兽医研究所农业部兽用生物制品工程技术重点实验室李文良博士保存。
1.1.2 各种试剂
由江苏TranszolUP试剂、一步法PTPCR试剂盒、Taq酶、大肠杆菌DH5α感受态细胞购自北京全式金生物技术有限公司；TSA、TSB、麦康凯均购自原北京陆桥技术有限责任公司； 微量生化反应管及药敏试纸均购自原杭州天和微生物制剂有限公司。.
1.1.3 引物
参考已发表的文献：副流感 MF1（AGTGATCTAGATGATGATCCA）/MR1(GTTATTGATCCAATTGCTGT)[2]、小反刍兽疫 PPRVNF(ATTGTCCACTATTGAATCCTTGAT)/PPRVNR(TTGTCGTTGTAGACCTGACTGTTG)[3]、支原体MmF（5’CGAAAGCGGCTTACTGGCTTGTT3’）/MmR(5’TTGAGATTAGCTCCCCTTCACAG3’)。[4]
1.1.4 电泳缓冲液（TAE）试剂
50×TAE Buffer 配制方法：
1.称量氨基丁三醇?242g，Na2EDTA.2H2O 37.2g 于1L烧杯中；
2.向烧杯中加入约600ml去离子水，充分搅拌均匀；
3.加入57.1ml的冰乙酸，充分溶解；
4.用NaOH调pH至8.3，加去离子水定容至1L后，室温保存。
使用时稀释50倍 即1×TAE Buffer。
1.1.5 主要仪器
PCR仪：AmpGene公司生产，DNAThermol Cycler4800 型；低温台式高速离心机购自Beckman公司；YY2Ⅲ8B稳压稳流电泳仪购自北京六一仪器厂;721BR09310 型凝胶成像系统购自BioRad公司;CO2培养箱购自ThermoForma公司;兔血琼脂平板由广西兽医研究所细菌研究室制备。
1．2 方法
1.2.1 临床症状与病理变化观察
现场了解发病经过，剖解病死羊，肉眼观察各脏器形态变化并记录。
1.2.2 提取RNA
取血清样品和鼻拭子样品200μL，加入1mL TranszolUP,按照说明书提取总RNA,最终溶于无RNase水中。
1.2.3 提取DNA
DNA采取常规酚氯仿抽提法提取。
1.1ml的全血/新鲜组织加入1ml的灭菌水，颠倒混匀（新鲜组织需碾磨），5000转离 心10分钟，弃上清。管底应该有沉淀。重复两次。
2.取250ul的上述液体加入50ul的DNA裂解液，5ul的蛋白酶K混匀。
3.54度水浴30分钟。
4.消化完成后加入等体积的酚氯仿混合液（1:1），剧烈震荡，使其变成奶咖色。
5.12000转离心5分钟。
6.取上清480ul，注意不要洗到中间介质以及下层液体。
7.加入等体积的氯仿，颠倒混匀。
8.12000转离心5分钟。
9.取上清400ul，注意不要洗到中间介质以及下层液体。
10.加入10分之一的醋酸钠以及2.5倍的无水乙醇，颠倒混匀。
11.放入冰箱静置过夜。
12.取出后12000转离心15分钟，弃上清，倒置。
13.加入500ul 无水乙醇，使其白色沉淀悬浮，颠倒混匀数次。
14.12000转离心5分钟。
15.弃上清，然后室温开盖静置分钟使其乙醇挥发干净。
16.加入灭菌水溶解DNA，一般加入20ul灭菌水溶解。
1.2.4 病原检测
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/852.html
