热应激对乳腺上皮细胞基因表达的影响
在炎热的气候条件下，热应激是负面影响奶牛产量的一个主要原因，热应激带来的经济损失不可估量。奶牛乳腺上皮细胞对热的反应是一种强烈的全身急性反应；在环境热负荷的作用下，乳腺上皮细胞内外的信号协调整体的代谢反应。本实验目的是通过基因芯片分析探究热应激对体外培养牛乳腺上皮细胞基因表达的影响。在热应激和正常的奶牛乳腺上皮细胞中，其中43000个转录本中有2716个基因表达呈显著差异，差异基因中热休克蛋白家族基因的表达有不同程度升高。GO和KEGG通路分析表明，这些差异表达的基因参与到调节细胞骨架、细胞周期和热应激反应过程的不同途径。该研究结果表明了热应激反应与基因表达谱之间的相互作用，该结果为进一步了解热应激对奶牛乳腺的潜在影响提供了研究依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 乳腺上皮细胞培养2
1．1．1 实验材料 2
1．1．2 试剂 2
1．1．3 仪器2
1．1．4 乳腺上皮细胞的培养2
1．1．5 奶牛乳腺上皮细胞的纯化、培养及鉴定3
1.2方法 3
1.2.1细胞热处理3
1.2.2基因芯片实验3
1.2.3荧光定量 PCR 3
2结果分析4
2.1基因芯片结果4
2.2荧光定量 PCR结果4
2.3GO分析5
2.4KEGG通路分析6
2．5 与热休克蛋白相关的差异表达基因6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
热应激对乳腺上皮细胞基因表达的影响
引言
引言
在全球变暖问题不断加剧的大环境下，热应激已对畜牧生产构成了非常严重的危害。于是近年来众多国内外学者对热应激进行了越来越多的研究，主要包括：热应激对奶牛产奶量的影响、对乳品质的影响、对奶牛生理指标的影响、对奶牛采食量和消化的影响、对激素代谢的影响以及对繁殖性能的影响等。这些研究发现夏季持续的高温应激对奶牛的产奶量会产生严重影响， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
其中高温应激首先会降低乳蛋白的合成量[1]。Cavestany等研究发现奶牛在夏季，其受孕率一般会从较冷月份的40~60%下降到10~20％或更低 [2]。对于热应激，目前奶牛生产中缓解热应激主要是通过物理手段和营养管理。物理手段如增加遮荫棚，安装风扇，喷淋、喷雾等措施。从营养角度主要是通过调整日粮结构，适当减少青贮料比例；采用全混合日粮(TMR)的饲喂方式避免牛挑食；补充矿物质如氯化钾；添加抗应激添加剂或瘤胃缓冲剂；日粮中添加某些复合酶制剂、瘤胃素、酵母培养物等；补充维生素；饲料中添加酸化剂如柠檬酸、延胡索酸等有机酸；脂肪产品代替部分玉米提供能量等方式来缓解热应激。
众所周知，在持续高温环境下，细胞会产生应激反应。奶牛热应激时乳腺上皮细胞会通过细胞内外的信号，协调细胞和动物整体的代谢过程，从而对环境中的热负荷做出反应。而在奶牛泌乳过程中乳汁的合成和分泌主要是由乳腺组织的乳腺上皮细胞主导，所以阐明高温应激环境直接对乳腺自身基因表达的影响，对于深入揭示高温应激环境下奶牛产奶量下降的机制有重要意义。本研究利用牛基因组芯片分析奶牛乳腺上皮细胞在 37℃正常培养和高温应激状态下基因表达水平的差异，并利用生物信息学方法筛选出在高温应激状态下特异性表达的基因。采用荧光定量PCR 技术对奶牛乳腺上皮细胞中差异表达基因进行验证。利用 Gene Ontology(GO)和 KEEG 分析对筛选出来的基因进行功能分类，并进一步分析相关通路。本实验结果可为热应激引起奶牛产奶量下降的诱因和机制提供理论支持。
1 材料与方法
1．1 乳腺上皮细胞培养
采集泌乳期奶牛的乳腺，采用组织块培养法培养原代乳腺上皮细胞，并对培养的细胞进行鉴定。
1．1．1 实验材料
自南京屠宰场选取泌乳期的中国荷斯坦牛，无菌术采取牛乳腺组织，置于预先加有抗生素（含青、链霉素的双抗）和培养液的瓶中，带回实验室备用。
1．1．2 试剂
大肠杆菌内毒素(O对BS)、MTT、DAPI （sigrna公司）；DMEM液体培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶(Trypsin)、青链霉素（Gibco公司）；Betatubilin抗体（Santa Cruz公司）；RIPA蛋白裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度试剂盒、角蛋白18单克隆抗体、β酪蛋白抗体、IgGFITC抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（碧云天公司）；SYBR ?Green PCR Master Mix（Toyobo公司）；ECL发光液、PVDF膜（Millipore公司）；其它试剂均为国产分析纯。
1．1．3 仪器
ABI7300实时定量PCR仪（美国MJ公司)；脱色摇床（南京大学 TY80S）；光学显微镜（Nikon YS100）光学成像系统（Nikon 80i）；凝胶成像系统（Las 4000）；CO2培养箱（SHELL/JB公司）；超纯水处理系统（Milipor biocel公司）；激光共聚焦显微镜（Leica公司）；实体显微镜（SMZ10，Nikon公司）；多波长酶标仪（Thermo Fisher公司）。
1．1．4 乳腺上皮细胞的培养
外科手术法釆取乳腺组织。用含有双抗的PBS液多次冲洗，置于含有双抗的DMEM培养液中,运至实验室备用。将用含有双抗(200 U/mL)的PBS液反复冲洗后的乳腺组织块及操作器械放入消毒完毕的超净台中，打开风箱，点燃酒精灯。用剪、摄将乳白色乳腺腺泡组织剪出，大小约1mm3。将剪出的组织块用含有双抗的DMEM培养液反复冲洗。将剪碎的组织块浸入含10%胎牛血清、200U/mL青链霉素的DMEM完全培养基中,用吸管吸取组织块并将组织块紧密均匀的接种在培养瓶中。将培养瓶置于含有5% CO2的培养箱中倒置培养6h,取出,并缓慢加入少量的DMEM完全培养基12h后加入足量的完全培养基(将组织浸没)。以后48h 换液1次，进行常规培养，待细胞密度达90%左右时纯化。
1．1．5 奶牛乳腺上皮细胞的纯化、培养及鉴定
取出培养箱中的原代细胞培养瓶，弃掉培养基，用含有双抗(200 U/mL)的PBS液冲洗3次。用胰蛋白酶处理细胞,在显微镜下观察,待成纤维细胞变圆时快速用含10%胎牛血清、200U/mL青链霉素的DMEM完全培养基终止反应。反复吹打并弃去上淸,使用PBS冲洗2次，然后将DMEM冲洗1次后加入完全培养基继续培养。经3至4次纯化后，可得到实验需要的纯度较高(大于95%)的奶牛乳腺上皮细胞。上皮细胞经免疫组化鉴定后，可以用于后续试验。
1．2 方法
1．2．1 细胞热处理
将细胞分为两组： 37℃正常培养组和 40.5℃热处理组。将细胞放置于 40.5℃的水浴箱中高温处理 0.5 小时。处理后在正常环境下培养，待细胞恢复6小时后收集。本试验重复三次。
1．2．2 基因芯片实验
芯片实验选用 Affymetrix 公司的牛基因组芯片。使用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂提取组织总RNA。提取得到的对照组与实验组总 RNA 经过琼脂糖凝胶电泳和检测 260/280 nm 光吸收的方法测定质量。RNA 合格后用于芯片实验。芯片实验由上海伯豪生物科技有限公司代为测定。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 乳腺上皮细胞培养2
1．1．1 实验材料 2
1．1．2 试剂 2
1．1．3 仪器2
1．1．4 乳腺上皮细胞的培养2
1．1．5 奶牛乳腺上皮细胞的纯化、培养及鉴定3
1.2方法 3
1.2.1细胞热处理3
1.2.2基因芯片实验3
1.2.3荧光定量 PCR 3
2结果分析4
2.1基因芯片结果4
2.2荧光定量 PCR结果4
2.3GO分析5
2.4KEGG通路分析6
2．5 与热休克蛋白相关的差异表达基因6
3讨论 7
致谢8
参考文献8
热应激对乳腺上皮细胞基因表达的影响
引言
引言
在全球变暖问题不断加剧的大环境下，热应激已对畜牧生产构成了非常严重的危害。于是近年来众多国内外学者对热应激进行了越来越多的研究，主要包括：热应激对奶牛产奶量的影响、对乳品质的影响、对奶牛生理指标的影响、对奶牛采食量和消化的影响、对激素代谢的影响以及对繁殖性能的影响等。这些研究发现夏季持续的高温应激对奶牛的产奶量会产生严重影响， *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
其中高温应激首先会降低乳蛋白的合成量[1]。Cavestany等研究发现奶牛在夏季，其受孕率一般会从较冷月份的40~60%下降到10~20％或更低 [2]。对于热应激，目前奶牛生产中缓解热应激主要是通过物理手段和营养管理。物理手段如增加遮荫棚，安装风扇，喷淋、喷雾等措施。从营养角度主要是通过调整日粮结构，适当减少青贮料比例；采用全混合日粮(TMR)的饲喂方式避免牛挑食；补充矿物质如氯化钾；添加抗应激添加剂或瘤胃缓冲剂；日粮中添加某些复合酶制剂、瘤胃素、酵母培养物等；补充维生素；饲料中添加酸化剂如柠檬酸、延胡索酸等有机酸；脂肪产品代替部分玉米提供能量等方式来缓解热应激。
众所周知，在持续高温环境下，细胞会产生应激反应。奶牛热应激时乳腺上皮细胞会通过细胞内外的信号，协调细胞和动物整体的代谢过程，从而对环境中的热负荷做出反应。而在奶牛泌乳过程中乳汁的合成和分泌主要是由乳腺组织的乳腺上皮细胞主导，所以阐明高温应激环境直接对乳腺自身基因表达的影响，对于深入揭示高温应激环境下奶牛产奶量下降的机制有重要意义。本研究利用牛基因组芯片分析奶牛乳腺上皮细胞在 37℃正常培养和高温应激状态下基因表达水平的差异，并利用生物信息学方法筛选出在高温应激状态下特异性表达的基因。采用荧光定量PCR 技术对奶牛乳腺上皮细胞中差异表达基因进行验证。利用 Gene Ontology(GO)和 KEEG 分析对筛选出来的基因进行功能分类，并进一步分析相关通路。本实验结果可为热应激引起奶牛产奶量下降的诱因和机制提供理论支持。
1 材料与方法
1．1 乳腺上皮细胞培养
采集泌乳期奶牛的乳腺，采用组织块培养法培养原代乳腺上皮细胞，并对培养的细胞进行鉴定。
1．1．1 实验材料
自南京屠宰场选取泌乳期的中国荷斯坦牛，无菌术采取牛乳腺组织，置于预先加有抗生素（含青、链霉素的双抗）和培养液的瓶中，带回实验室备用。
1．1．2 试剂
大肠杆菌内毒素(O对BS)、MTT、DAPI （sigrna公司）；DMEM液体培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶(Trypsin)、青链霉素（Gibco公司）；Betatubilin抗体（Santa Cruz公司）；RIPA蛋白裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度试剂盒、角蛋白18单克隆抗体、β酪蛋白抗体、IgGFITC抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG（碧云天公司）；SYBR ?Green PCR Master Mix（Toyobo公司）；ECL发光液、PVDF膜（Millipore公司）；其它试剂均为国产分析纯。
1．1．3 仪器
ABI7300实时定量PCR仪（美国MJ公司)；脱色摇床（南京大学 TY80S）；光学显微镜（Nikon YS100）光学成像系统（Nikon 80i）；凝胶成像系统（Las 4000）；CO2培养箱（SHELL/JB公司）；超纯水处理系统（Milipor biocel公司）；激光共聚焦显微镜（Leica公司）；实体显微镜（SMZ10，Nikon公司）；多波长酶标仪（Thermo Fisher公司）。
1．1．4 乳腺上皮细胞的培养
外科手术法釆取乳腺组织。用含有双抗的PBS液多次冲洗，置于含有双抗的DMEM培养液中,运至实验室备用。将用含有双抗(200 U/mL)的PBS液反复冲洗后的乳腺组织块及操作器械放入消毒完毕的超净台中，打开风箱，点燃酒精灯。用剪、摄将乳白色乳腺腺泡组织剪出，大小约1mm3。将剪出的组织块用含有双抗的DMEM培养液反复冲洗。将剪碎的组织块浸入含10%胎牛血清、200U/mL青链霉素的DMEM完全培养基中,用吸管吸取组织块并将组织块紧密均匀的接种在培养瓶中。将培养瓶置于含有5% CO2的培养箱中倒置培养6h,取出,并缓慢加入少量的DMEM完全培养基12h后加入足量的完全培养基(将组织浸没)。以后48h 换液1次，进行常规培养，待细胞密度达90%左右时纯化。
1．1．5 奶牛乳腺上皮细胞的纯化、培养及鉴定
取出培养箱中的原代细胞培养瓶，弃掉培养基，用含有双抗(200 U/mL)的PBS液冲洗3次。用胰蛋白酶处理细胞,在显微镜下观察,待成纤维细胞变圆时快速用含10%胎牛血清、200U/mL青链霉素的DMEM完全培养基终止反应。反复吹打并弃去上淸,使用PBS冲洗2次，然后将DMEM冲洗1次后加入完全培养基继续培养。经3至4次纯化后，可得到实验需要的纯度较高(大于95%)的奶牛乳腺上皮细胞。上皮细胞经免疫组化鉴定后，可以用于后续试验。
1．2 方法
1．2．1 细胞热处理
将细胞分为两组： 37℃正常培养组和 40.5℃热处理组。将细胞放置于 40.5℃的水浴箱中高温处理 0.5 小时。处理后在正常环境下培养，待细胞恢复6小时后收集。本试验重复三次。
1．2．2 基因芯片实验
芯片实验选用 Affymetrix 公司的牛基因组芯片。使用 Invitrogen 公司的 Trizol 试剂提取组织总RNA。提取得到的对照组与实验组总 RNA 经过琼脂糖凝胶电泳和检测 260/280 nm 光吸收的方法测定质量。RNA 合格后用于芯片实验。芯片实验由上海伯豪生物科技有限公司代为测定。
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