苏淮猪smad7基因3’utr克隆和多态位点分析
TGF-β信号通路参与细胞增殖、分化、凋亡以及衰老的过程，并且在雌性生殖过程中发挥重要的功能。SMAD7作为TGF-β信号通路中的抑制型SMAD，主要通过负反馈调控TGF-β信号通路来发挥作用。本文以苏淮猪为研究对象，采用PCR扩增和产物测序技术获得苏淮猪SMAD7基因3’ 非编码区（3’ -UTR）核苷酸序列，并利用生物信息学方法分析其序列特征；利用DNA混池测序技术筛选SNP位点，通过AS-PCR方法分析SNP位点多态性。结果发现苏淮猪SMAD7基因3’-UTR序列长度为1092 bp，与牛、山羊的一致性在80%以上，含有保守的polyA加尾信号和ARE；在终止子后第494位点发现1个SNP位点（*494G>A），并成功建立该位点的AS-PCR分型方法；对该位点多态性进行统计分析。多态性分析发现苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点存在3种基因型，其中GA型为优势基因型，基因频率为0.521；G型为优势等位基因，频率是0.5719；苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点的多态信息含量（PIC）为0.489，是一个高度多态位点，杂合度（He）为0.489，为中等变异程度位点；Hardy-Weinberg平衡性检验不显著（P>0.05），表明苏淮猪群体SMAD7基因*494G>A位点未达到Hardy-Weinberg平衡。研究结果为进一步解析苏淮猪SMAD7基因的表达调控提供一定的理论依据。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验动物 2
1.2主要仪器 2
1.3溶液的配制 2
1.3.1电泳液的配制2
1.3.2电泳试剂的配制3
1.4提取基因组DNA 3
1.5组织总RNA提取与反转录3
1.6 PCR反应与测序3
1.7 SMAD7基因3′UTR多态位点筛选3
1.8基因分型3
1.9遗传参数的计算4
1.9.1基因型频率和基因频率4
1.9.2多态信息含量4
1.9.3基因杂合度4
2结果与分析4 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
2.1苏淮猪SAMD7基因3’UTR扩增结果4
2.2苏淮猪SMAD7基因3’UTR序列分析5
2.3苏淮猪SMAD7基因3’UTR多态位点筛选6
2.4苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点ASPCR分型方法的建立7
2.5苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点多态性分析8
2.6苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点遗传多样性8
3讨论 8
致谢9
参考文献9
图1 苏淮猪SMAD7基因3’UTR扩增产物电泳图谱4
图2 苏淮猪SMAD7基因3’UTR序列与人、鼠、牛、山羊、鸡同源性比对6
图3 SMAD7基因3’UTR*494G>A多态位点7
图4 鉴定*494G>A位点的不同基因型7
表1引物序列及PCR参数3
表2动物不同物种SMAD7基因3’UTR序列同源性分析5
表3 苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点基因型频率、等位基因频率表8
表4苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点遗传多态性指标8
苏淮猪SMAD7基因3’UTR克隆和多态位点分析
引言
引言
母猪的繁殖性状是一个重要的经济性状，它由一系列主效基因或者数量性状位点（Quantitative trait locus，QTLs）控制。产仔数是母猪繁殖性状中最重要的考量指标之一，找到影响产仔数的基因或标记有重要的经济及科研价值[1]。通过遗传标记来提高猪的繁殖性能已经成为育种工作的首要任务。研究发现TGFβ（transforming growth factor β）信号通路在细胞细胞增殖、分化、凋亡以及衰老过程中起重要作用[2，3]，且在雌性生殖过程中不可或缺[4，5]。TGFβ信号通路失调会导致一系列生殖系统损伤如雌性不育、多囊卵泡综合征等[6]。卵巢组织中TGFβ信号通路分子的表达水平与哺乳动物繁殖性能关系密切[7]。在猪卵巢组织中，激活TGFβ信号通路可抑制卵泡颗粒细胞凋亡、促进颗粒细胞增殖，而抑制TGFβ信号通路则增加卵泡颗粒细胞凋亡，促进卵泡闭锁[8]。
SMAD7蛋白（Sma and Madrelated protein）是TGFβ信号通路的胞内效应物，其中抑制性SMAD蛋白（inhibitory Smads，ISmads）即SMAD6和SMAD7，是TGFβ信号通路的关键调控分子[910]。SMAD7作为抗TGFβ信号通路的抑制型SMAD，主要通过负反馈对通路进行调控。生化实验发现SMAD7是TGFβ 超家族的广谱抑制剂, 能同时抑制TGFβ和BMP亚家族的信号传递，而 SMAD7 通常是BMP 亚家族特异性的[9]。研究表明，SMAD7能对特异性的与TGFβ受体形成复合体，从而影响TGFβ受体对RSMAD的募集与激活，同时，SMAD7能招募E3泛素化酶导致TGFβ受体1的泛素化降解，从而阻断TGFβ信号通路入核转运、DNA 结合以及转录过程[11]。SMAD7主要在肾脏、肺和卵巢等组织中表达[12]，免疫组化发现SMAD7在卵巢的窦前卵泡、窦状卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中都有表达[13]，说明在TGFβ信号通路调节卵泡发育的过程中SMAD7起到一定作用。
单核苷酸多态（single nucleotide polymophism，SNP）是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。有些 SNP 位点还影响基因的功能，从而导致生物性状改变甚至致病，如荣恩光等[14]发现，中国美利奴羊DLX3基因３’UTR区的多态性与绵羊毛发卷曲度性状显著相关；李小楷等[15]研究了猪胰岛素样生长因子I（IGFI）基因SNP位点（rs322131043）并发现基因杂合（AG）型猪的体重、体长、胸围 、体高平均值在各日龄基本上都比基因纯合（AA/GG）型的低。SNP 位点的遗传多样性可以反映出该突变在群体中的分布情况，这种分布同时受到自然选择和人为选择的影响，自然选择的结果使有利于群体生存能力的等位基因频率的升高，而人工选择的结果使满足人的生产性能的等位基因频率的升高，一般在没有受到任何选择的情况下，该位点在理论上应该符合 HardyWeinberg 定律，群体处于 HardyWeinberg 平衡状态，且在不同品种间分布是相似的[12]。
苏淮猪（新淮猪瘦肉型母本新品系）是1998年开始培育的新型猪种以抗逆性强、产仔数高的新淮猪为杂交母本，生长速度快、瘦肉率高的大约克夏猪种为杂交父本[16]。目前关于苏淮猪的研究相对较少。本文以苏淮猪为研究对象，采用PCR测序获得苏淮猪基因SMAD7基因3’UTR序列，生物信息学方法分析其序列特征，利用池DNA测序筛选SNP位点，通过ASPCR方法分析SNP位点多态性，为了解苏淮猪种质特征的分子遗传基础和苏淮猪的育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
在淮阴种猪场选择健康无病、体况良好的苏淮母猪167头，采集耳组织样约0.2g，置于装有75%酒精的2mL离心管中，用冰盒带回实验室，用于提取基因组DNA。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法2
1.1实验动物 2
1.2主要仪器 2
1.3溶液的配制 2
1.3.1电泳液的配制2
1.3.2电泳试剂的配制3
1.4提取基因组DNA 3
1.5组织总RNA提取与反转录3
1.6 PCR反应与测序3
1.7 SMAD7基因3′UTR多态位点筛选3
1.8基因分型3
1.9遗传参数的计算4
1.9.1基因型频率和基因频率4
1.9.2多态信息含量4
1.9.3基因杂合度4
2结果与分析4 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
2.1苏淮猪SAMD7基因3’UTR扩增结果4
2.2苏淮猪SMAD7基因3’UTR序列分析5
2.3苏淮猪SMAD7基因3’UTR多态位点筛选6
2.4苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点ASPCR分型方法的建立7
2.5苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点多态性分析8
2.6苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点遗传多样性8
3讨论 8
致谢9
参考文献9
图1 苏淮猪SMAD7基因3’UTR扩增产物电泳图谱4
图2 苏淮猪SMAD7基因3’UTR序列与人、鼠、牛、山羊、鸡同源性比对6
图3 SMAD7基因3’UTR*494G>A多态位点7
图4 鉴定*494G>A位点的不同基因型7
表1引物序列及PCR参数3
表2动物不同物种SMAD7基因3’UTR序列同源性分析5
表3 苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点基因型频率、等位基因频率表8
表4苏淮猪SMAD7基因*494G>A位点遗传多态性指标8
苏淮猪SMAD7基因3’UTR克隆和多态位点分析
引言
引言
母猪的繁殖性状是一个重要的经济性状，它由一系列主效基因或者数量性状位点（Quantitative trait locus，QTLs）控制。产仔数是母猪繁殖性状中最重要的考量指标之一，找到影响产仔数的基因或标记有重要的经济及科研价值[1]。通过遗传标记来提高猪的繁殖性能已经成为育种工作的首要任务。研究发现TGFβ（transforming growth factor β）信号通路在细胞细胞增殖、分化、凋亡以及衰老过程中起重要作用[2，3]，且在雌性生殖过程中不可或缺[4，5]。TGFβ信号通路失调会导致一系列生殖系统损伤如雌性不育、多囊卵泡综合征等[6]。卵巢组织中TGFβ信号通路分子的表达水平与哺乳动物繁殖性能关系密切[7]。在猪卵巢组织中，激活TGFβ信号通路可抑制卵泡颗粒细胞凋亡、促进颗粒细胞增殖，而抑制TGFβ信号通路则增加卵泡颗粒细胞凋亡，促进卵泡闭锁[8]。
SMAD7蛋白（Sma and Madrelated protein）是TGFβ信号通路的胞内效应物，其中抑制性SMAD蛋白（inhibitory Smads，ISmads）即SMAD6和SMAD7，是TGFβ信号通路的关键调控分子[910]。SMAD7作为抗TGFβ信号通路的抑制型SMAD，主要通过负反馈对通路进行调控。生化实验发现SMAD7是TGFβ 超家族的广谱抑制剂, 能同时抑制TGFβ和BMP亚家族的信号传递，而 SMAD7 通常是BMP 亚家族特异性的[9]。研究表明，SMAD7能对特异性的与TGFβ受体形成复合体，从而影响TGFβ受体对RSMAD的募集与激活，同时，SMAD7能招募E3泛素化酶导致TGFβ受体1的泛素化降解，从而阻断TGFβ信号通路入核转运、DNA 结合以及转录过程[11]。SMAD7主要在肾脏、肺和卵巢等组织中表达[12]，免疫组化发现SMAD7在卵巢的窦前卵泡、窦状卵泡的卵母细胞和颗粒细胞中都有表达[13]，说明在TGFβ信号通路调节卵泡发育的过程中SMAD7起到一定作用。
单核苷酸多态（single nucleotide polymophism，SNP）是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。一般来说，一个SNP位点只有两种等位基因，因此又叫双等位基因。有些 SNP 位点还影响基因的功能，从而导致生物性状改变甚至致病，如荣恩光等[14]发现，中国美利奴羊DLX3基因３’UTR区的多态性与绵羊毛发卷曲度性状显著相关；李小楷等[15]研究了猪胰岛素样生长因子I（IGFI）基因SNP位点（rs322131043）并发现基因杂合（AG）型猪的体重、体长、胸围 、体高平均值在各日龄基本上都比基因纯合（AA/GG）型的低。SNP 位点的遗传多样性可以反映出该突变在群体中的分布情况，这种分布同时受到自然选择和人为选择的影响，自然选择的结果使有利于群体生存能力的等位基因频率的升高，而人工选择的结果使满足人的生产性能的等位基因频率的升高，一般在没有受到任何选择的情况下，该位点在理论上应该符合 HardyWeinberg 定律，群体处于 HardyWeinberg 平衡状态，且在不同品种间分布是相似的[12]。
苏淮猪（新淮猪瘦肉型母本新品系）是1998年开始培育的新型猪种以抗逆性强、产仔数高的新淮猪为杂交母本，生长速度快、瘦肉率高的大约克夏猪种为杂交父本[16]。目前关于苏淮猪的研究相对较少。本文以苏淮猪为研究对象，采用PCR测序获得苏淮猪基因SMAD7基因3’UTR序列，生物信息学方法分析其序列特征，利用池DNA测序筛选SNP位点，通过ASPCR方法分析SNP位点多态性，为了解苏淮猪种质特征的分子遗传基础和苏淮猪的育种提供依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物
在淮阴种猪场选择健康无病、体况良好的苏淮母猪167头，采集耳组织样约0.2g，置于装有75%酒精的2mL离心管中，用冰盒带回实验室，用于提取基因组DNA。
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