猪源屎肠球菌的分离鉴定及耐药性调查
肠球菌为革兰阳性（G+）球菌，为球形或卵圆形，呈链状排列，广泛分布于自然环境及人和动物消化道。自1984年从链球菌属中分出来自行成属，从最初的2个种变成了现在的41个种[1]。肠球菌是人类和动物肠道内正常菌群之一，曾应用于食品工程中，用于发酵和防制食物腐烂，还可以利用其作为益生菌在人体和动物体内，用于治疗腹泻、肠应激综合症，降低胆固醇水平，或提高免疫力、改善生长等。作为一种机会致病菌，肠球菌可引起人腹膜炎、脑膜炎、尿道炎及心内膜炎等；也可引起动物如猪的败血症、脑膜炎、关节炎，鸡鸭的败血症，羊的脑炎等[2]。因此成为近年来的重要研究对象，在公共卫生学上具有重要意义。耐药屎肠球菌感染成为重要威胁。本文从江苏某养殖场分离的肠球菌菌株中，鉴定出屎肠球菌，并对其进行常用抗菌药物的耐药性检测，分析猪源屎肠球菌对13种抗菌药的耐药率，为后续研究和猪场指导用药等提供指导参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1菌株2
1.1.2主要试剂2
1.1.3主要仪器2
1.2 实验方法2
1.2.1 细菌的分离纯化及培养3
1.2.2 细菌DNA的粗提取3
1.2.3 PCR扩增 3
1.2.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳3
1.3药敏试验4
1.4 实验技术路线图4
2.结果及分析5
3讨论8
致谢8
参考文献8
猪源屎肠球菌的分离鉴定及耐药性调查
引言
肠球菌是革兰阳性（G+）球菌，是分布于人和动物消化道内的正常菌群之一，特定条件下可引发机体感染，成为一种重要的机会致病菌。肠球菌可引起尿道感染、伤口感染、菌血症、败血症、心内膜炎等症。随着抗生素的大量使用或滥用，导致耐药菌株的大量产生，机体正常菌群失调，临床上肠球菌感染不断上升，成为医院内感染的主要致病菌[3]。
在临床肠球菌感染中，粪肠球菌占据优势，约占80%~90%；其次是屎肠球菌，约占5%~1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
5%；其他肠球菌属约占5%以下。在美国，肠球菌已经成为医院内尿路感染和创伤感染的第二位致病菌，菌血症的第三位致病菌[4]。
肠球菌对目前常用的一些抗生素天然耐药，如头孢类抗菌药等；更重要的是，肠球菌对常用的另一些抗生素易产生获得性耐药，如对氨基糖苷类庆大霉素的高水平耐药。特别是对临床常用的糖肽类抗生素如万古霉素耐药的肠球菌（vancomycinresistant enterococci）菌株在逐年增加[5]。在临床上，肠球菌对正常人不致病，但对免疫低下者可致机体多系统感染性疾病，给临床抗感染治疗带来了极大困难[6]。我国上海、北京、广州等许多地区均有万古霉素耐药肠球菌的报道，如张正等[7]对2000年1月～2012年12月分离的553株肠球菌进行了耐药分析，发现肠球菌对万古霉素耐药率达到2.94%。
到目前为止，关于肠球菌耐药性的研究主要集中在人类，动物源特别是猪源肠球菌的地方性流行趋势相对较少。鉴于动物源耐药肠球菌有向人类传播的潜在风险，基于全球健康（One Health）的概念的提出和推进，肠球菌耐药性的监测变得十分重要。本实验对猪场猪只的肠球菌进行分离纯化，并根据CLSI推荐的微量稀释法进行药敏试验，开展猪源肠球菌耐药性调查，为耐药肠球菌的防治和传播风险提供参考。
材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株 50株屎肠球菌。为2017年10月份，对来自江苏某养殖场健康猪粪便拭子分离纯化所得。
1.1.2 主要试剂 水解酪蛋白胨（MH）培养基、肠球菌培养基、TSB培养基、TE buffer、双蒸水、Taq酶等。
1.1.3 主要器材 恒温培养箱、冰箱、离心机、制冰机、水浴锅、DYY6C电泳仪、Alphalmager2200凝胶成像系统。
1.2 实验方法
1.2.1 细菌的分离纯化及鉴定
细菌的分离：将从健康猪粪便拭子在超净台中放入分装好的肠球菌培养基试管中，37℃ 180 rpm振摇培养33.5 h后用接种环将菌液分区接种于MH平板上。
细菌的纯化：待平板上长出单菌落之后，将接种环在酒精灯外焰灼烧完全后，冷却1min，挑取平板上的单菌落，用Z字划线法进行划线分离纯化，挑取的菌落用记号笔标注。
细菌保种：将已经纯化的细菌接种到含有TSB肉汤的EP管中，置于恒温箱37℃培养24 h，然后转移到2 mL冻存管于－20℃冰箱冻存，留待提取DNA。
细菌的鉴定：对需要进一步鉴定的纯培养细菌进行涂片染色镜检，观察其大小、形态和染色特征。
1.2.2 细菌DNA的粗提取
将冰箱内的冻存管取出，置于超净台下，放置一段时间，使菌液融化呈液态；取出高压好的1.5 mL EP管，加入1000 μL的MH培养液，然后加入50 μL菌液，并做好标记，置于摇床中，培养24 h。待长出细菌后，取出并第一次离心（离心条件6000r/min,4 ℃），离心10 min。然后弃上清液，加入100 μL TE buffer，重悬，再沸水浴10min，取出，冰水浴5 min，然后进行第二次离心（离心条件为12000 r/min，4℃），离心8 min。结束取出，取上清液[8]。
注意事项：
摇床培养的时间不宜过长，过长容易导致细菌死亡；离心过程中，严格遵守离心机使用流程，注意离心管保持对称，不够的用等量蒸馏水补齐。
1.2.3 PCR扩增
本次实验的PCR反应体系如下：
Mix 25 μL
上游引物 1.5 μL
下游引物 1.5 μL
模板 2 μL
dd H?O 20 μL
总体积 50 μL
PCR扩增程序如下：
94 ℃ 预变性10 min
94 ℃ 变性30 s
57 ℃ 退火30 s
72 ℃ 延伸3060 s
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1实验材料 2
1.1.1菌株2
1.1.2主要试剂2
1.1.3主要仪器2
1.2 实验方法2
1.2.1 细菌的分离纯化及培养3
1.2.2 细菌DNA的粗提取3
1.2.3 PCR扩增 3
1.2.4 PCR产物琼脂糖凝胶电泳3
1.3药敏试验4
1.4 实验技术路线图4
2.结果及分析5
3讨论8
致谢8
参考文献8
猪源屎肠球菌的分离鉴定及耐药性调查
引言
肠球菌是革兰阳性（G+）球菌，是分布于人和动物消化道内的正常菌群之一，特定条件下可引发机体感染，成为一种重要的机会致病菌。肠球菌可引起尿道感染、伤口感染、菌血症、败血症、心内膜炎等症。随着抗生素的大量使用或滥用，导致耐药菌株的大量产生，机体正常菌群失调，临床上肠球菌感染不断上升，成为医院内感染的主要致病菌[3]。
在临床肠球菌感染中，粪肠球菌占据优势，约占80%~90%；其次是屎肠球菌，约占5%~1 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
5%；其他肠球菌属约占5%以下。在美国，肠球菌已经成为医院内尿路感染和创伤感染的第二位致病菌，菌血症的第三位致病菌[4]。
肠球菌对目前常用的一些抗生素天然耐药，如头孢类抗菌药等；更重要的是，肠球菌对常用的另一些抗生素易产生获得性耐药，如对氨基糖苷类庆大霉素的高水平耐药。特别是对临床常用的糖肽类抗生素如万古霉素耐药的肠球菌（vancomycinresistant enterococci）菌株在逐年增加[5]。在临床上，肠球菌对正常人不致病，但对免疫低下者可致机体多系统感染性疾病，给临床抗感染治疗带来了极大困难[6]。我国上海、北京、广州等许多地区均有万古霉素耐药肠球菌的报道，如张正等[7]对2000年1月～2012年12月分离的553株肠球菌进行了耐药分析，发现肠球菌对万古霉素耐药率达到2.94%。
到目前为止，关于肠球菌耐药性的研究主要集中在人类，动物源特别是猪源肠球菌的地方性流行趋势相对较少。鉴于动物源耐药肠球菌有向人类传播的潜在风险，基于全球健康（One Health）的概念的提出和推进，肠球菌耐药性的监测变得十分重要。本实验对猪场猪只的肠球菌进行分离纯化，并根据CLSI推荐的微量稀释法进行药敏试验，开展猪源肠球菌耐药性调查，为耐药肠球菌的防治和传播风险提供参考。
材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 菌株 50株屎肠球菌。为2017年10月份，对来自江苏某养殖场健康猪粪便拭子分离纯化所得。
1.1.2 主要试剂 水解酪蛋白胨（MH）培养基、肠球菌培养基、TSB培养基、TE buffer、双蒸水、Taq酶等。
1.1.3 主要器材 恒温培养箱、冰箱、离心机、制冰机、水浴锅、DYY6C电泳仪、Alphalmager2200凝胶成像系统。
1.2 实验方法
1.2.1 细菌的分离纯化及鉴定
细菌的分离：将从健康猪粪便拭子在超净台中放入分装好的肠球菌培养基试管中，37℃ 180 rpm振摇培养33.5 h后用接种环将菌液分区接种于MH平板上。
细菌的纯化：待平板上长出单菌落之后，将接种环在酒精灯外焰灼烧完全后，冷却1min，挑取平板上的单菌落，用Z字划线法进行划线分离纯化，挑取的菌落用记号笔标注。
细菌保种：将已经纯化的细菌接种到含有TSB肉汤的EP管中，置于恒温箱37℃培养24 h，然后转移到2 mL冻存管于－20℃冰箱冻存，留待提取DNA。
细菌的鉴定：对需要进一步鉴定的纯培养细菌进行涂片染色镜检，观察其大小、形态和染色特征。
1.2.2 细菌DNA的粗提取
将冰箱内的冻存管取出，置于超净台下，放置一段时间，使菌液融化呈液态；取出高压好的1.5 mL EP管，加入1000 μL的MH培养液，然后加入50 μL菌液，并做好标记，置于摇床中，培养24 h。待长出细菌后，取出并第一次离心（离心条件6000r/min,4 ℃），离心10 min。然后弃上清液，加入100 μL TE buffer，重悬，再沸水浴10min，取出，冰水浴5 min，然后进行第二次离心（离心条件为12000 r/min，4℃），离心8 min。结束取出，取上清液[8]。
注意事项：
摇床培养的时间不宜过长，过长容易导致细菌死亡；离心过程中，严格遵守离心机使用流程，注意离心管保持对称，不够的用等量蒸馏水补齐。
1.2.3 PCR扩增
本次实验的PCR反应体系如下：
Mix 25 μL
上游引物 1.5 μL
下游引物 1.5 μL
模板 2 μL
dd H?O 20 μL
总体积 50 μL
PCR扩增程序如下：
94 ℃ 预变性10 min
94 ℃ 变性30 s
57 ℃ 退火30 s
72 ℃ 延伸3060 s
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