马链球菌兽疫亚种链激酶原核表达及基因缺失株构建
马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equi ssp. zooepidemicus，SEZ）是一种重要的人畜共患病病原，能引起多种动物的发病。链激酶（Streptokinase，SK）与纤维蛋白溶解酶酶原激活的过程有关，有利于病原菌在体内的扩散。本实验将SK基因与pET-28a(+)载体连接，构成pET-28a(+)::SK重组质粒，转化进入大肠杆菌BL21中，诱导表达后得到了48 kDa左右的重组融合蛋白。此外，构建重组穿梭质粒pSET-4S::△SK，电转化进入SEZ ATCC35246菌株，通过同源重组方法构建了SEZ SK基因敲除突变株，为下一步研究SK对细菌致病作用奠定了基础。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料1
1.1菌株和质粒 1
1.2主要试剂 2
2方法2
2.1原核表达载体构建2
2.1.1 SK基因的扩增2
2.1.2 目的基因连接pET28a(+)质粒2
2.1.3将目的基因转化至DH5α感受态细胞3
2.2 重组SK诱导表达 3
2.2.1 转化到BL213
2.2.2 诱导表达3
2.3 纯化蛋白3
2.4△SK片段上下游臂的融合3
2.4.1上下游臂扩增3
2.4.2△SK片段的融合回收4
2.5 pMD19T::△SK载体的构建4
2.5.1连接pMD19T4
2.5.2转化至DH5α5
2.6 pSET4S::△SK载体的构建5
2.7电转化到SEZ ATCC35246感受态细胞5
2.8缺失株筛选及鉴定5
2.8.1传代并筛选缺失株5
2.8.2粗提基因组PCR检测5
2.8.3抗性培养6
3结果6
3.1原核表达载体构建6
3.1.1 SK基因的扩增6
3.1.2 pET28a(+)::SK重组质粒构建6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
3.2诱导表达7
3.3上清蛋白纯化8
3.4 △SK上下游融合片段的获取8
3.5 pMD19T::△SK载体的构建8
3.6 pSET4S::△SK载体的构建9
3.7缺失株筛选及鉴定10
4讨论10
致谢11
参考文献11图1 pET28a(+)::SK重组质粒PCR鉴定结果6
图2 pET28a(+)::SK重组质粒双酶切鉴定6
图3 pET28a(+)::SK重组质粒PCR鉴定7
图4超声波裂解蛋白的SDSPAGE分析7
图5纯化蛋白SDSPAGE8
图6 pMD19T::△SK重组质粒PCR检测8
图7 pMD19T::△SK重组质粒双酶切鉴定9
图8 pSET4S::△SK重组质粒PCR鉴定9
图9 pSET4S::△SK重组质粒双酶切鉴定9
图10缺失株粗提基因组PCR鉴定10
马链球菌兽疫亚种链激酶原核表达及基因缺失株构建
引言
马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, SEZ)是一种能引发多种动物出现如下症状，如脑膜炎、关节炎、乳腺炎、败血症、心内膜炎等的革兰氏阳性菌[l,2]。人类可由于与发病动物密切接触、外伤途径而感染[35]，因此SEZ是一种重要的人畜共患病病原[6]。SEZ在我国主要在猪群中流行[7]，1975年四川省曾爆发该菌所致的猪链球菌病，造成巨大的经济损失。
链激酶（Streptokinase,SK）是一种胞外非酶蛋白质由A、C、G群链球菌中β溶血性链球菌分泌，能和纤维蛋白溶解酶酶原结合，将纤维蛋白溶解酶酶原激活为纤维蛋白溶解酶。Boyle[8]等研究发现，病原菌侵袭后，纤溶酶能够溶解侵袭部位的纤维蛋白，通过水解胞外的基质蛋白，并且激活潜在的蚀原酶和其它的血浆酶原，从而有利于病原菌在体内扩散。纤维蛋白溶酶亦可能在感染后疾病如肾小球肾炎中发挥作用，因为通过补体激活途径诱导炎症反应[9]。因此链激酶被认为是一种重要的致病因子。
本实验将SK基因转化至大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达获得重组SK蛋白，并利用同源重组技术构建了SEZ ATCC35246菌株SK缺失突变株，为下一步确定其对细菌致病作用奠定了基础。
1材料
1.1菌株和质粒
马链球菌兽疫亚种（SEZ）ATCC35246由本实验室保存，SEZ菌株均用THB培养，培养中添加抗生素，终浓度：壮观霉素（Spc）100 (g/mL。大肠杆菌用LB培养，培养基中添加抗生素，终浓度分别为：壮观霉素（Spc）50 (g/mL，氨苄西林(Amp) 50 (g/mL，卡那霉素(Kan) 50 (g/mL。缺失用自杀质粒pSET4s由日本学者Takamatsu馈赠。
1.2 主要试剂
2×PCR Mix、T4 DNA连接酶、限制性内切酶以及DNA Marker购自大连TaKaRa公司。2×Taq酶购自南京博尔迪生物科技有限公司。DNA凝胶回收试剂盒和质粒DNA小量提取试剂盒购自OMEGA公司。LB培养基、酵母浸出物、水解酪蛋白为Oxoid产品。每1 L的LB液体培养基含有10 g胰化蛋白胨、5 g酵母浸出物和10 g NaCl。抗性培养基抗生素终浓度为50 ng/L。固体培养平板为LB或THB液体培养基加入1.5 %琼脂，灭菌后分装到平板。
引物、 DH5α感受态购自鼎国昌盛生物技术有限公司。
2方法
2.1原核表达载体构建
2.1.1 SK基因的扩增
SK基因的扩增
50 μL反应体系：
ddH2O 20 μL
2×PCR mix 25 μL
上游引物Proup 2.0 μL
下游引物Prodown 2.0 μL
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料1
1.1菌株和质粒 1
1.2主要试剂 2
2方法2
2.1原核表达载体构建2
2.1.1 SK基因的扩增2
2.1.2 目的基因连接pET28a(+)质粒2
2.1.3将目的基因转化至DH5α感受态细胞3
2.2 重组SK诱导表达 3
2.2.1 转化到BL213
2.2.2 诱导表达3
2.3 纯化蛋白3
2.4△SK片段上下游臂的融合3
2.4.1上下游臂扩增3
2.4.2△SK片段的融合回收4
2.5 pMD19T::△SK载体的构建4
2.5.1连接pMD19T4
2.5.2转化至DH5α5
2.6 pSET4S::△SK载体的构建5
2.7电转化到SEZ ATCC35246感受态细胞5
2.8缺失株筛选及鉴定5
2.8.1传代并筛选缺失株5
2.8.2粗提基因组PCR检测5
2.8.3抗性培养6
3结果6
3.1原核表达载体构建6
3.1.1 SK基因的扩增6
3.1.2 pET28a(+)::SK重组质粒构建6 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: @351916072@
3.2诱导表达7
3.3上清蛋白纯化8
3.4 △SK上下游融合片段的获取8
3.5 pMD19T::△SK载体的构建8
3.6 pSET4S::△SK载体的构建9
3.7缺失株筛选及鉴定10
4讨论10
致谢11
参考文献11图1 pET28a(+)::SK重组质粒PCR鉴定结果6
图2 pET28a(+)::SK重组质粒双酶切鉴定6
图3 pET28a(+)::SK重组质粒PCR鉴定7
图4超声波裂解蛋白的SDSPAGE分析7
图5纯化蛋白SDSPAGE8
图6 pMD19T::△SK重组质粒PCR检测8
图7 pMD19T::△SK重组质粒双酶切鉴定9
图8 pSET4S::△SK重组质粒PCR鉴定9
图9 pSET4S::△SK重组质粒双酶切鉴定9
图10缺失株粗提基因组PCR鉴定10
马链球菌兽疫亚种链激酶原核表达及基因缺失株构建
引言
马链球菌兽疫亚种(Streptococcus equi ssp. zooepidemicus, SEZ)是一种能引发多种动物出现如下症状，如脑膜炎、关节炎、乳腺炎、败血症、心内膜炎等的革兰氏阳性菌[l,2]。人类可由于与发病动物密切接触、外伤途径而感染[35]，因此SEZ是一种重要的人畜共患病病原[6]。SEZ在我国主要在猪群中流行[7]，1975年四川省曾爆发该菌所致的猪链球菌病，造成巨大的经济损失。
链激酶（Streptokinase,SK）是一种胞外非酶蛋白质由A、C、G群链球菌中β溶血性链球菌分泌，能和纤维蛋白溶解酶酶原结合，将纤维蛋白溶解酶酶原激活为纤维蛋白溶解酶。Boyle[8]等研究发现，病原菌侵袭后，纤溶酶能够溶解侵袭部位的纤维蛋白，通过水解胞外的基质蛋白，并且激活潜在的蚀原酶和其它的血浆酶原，从而有利于病原菌在体内扩散。纤维蛋白溶酶亦可能在感染后疾病如肾小球肾炎中发挥作用，因为通过补体激活途径诱导炎症反应[9]。因此链激酶被认为是一种重要的致病因子。
本实验将SK基因转化至大肠杆菌BL21中，用IPTG诱导表达获得重组SK蛋白，并利用同源重组技术构建了SEZ ATCC35246菌株SK缺失突变株，为下一步确定其对细菌致病作用奠定了基础。
1材料
1.1菌株和质粒
马链球菌兽疫亚种（SEZ）ATCC35246由本实验室保存，SEZ菌株均用THB培养，培养中添加抗生素，终浓度：壮观霉素（Spc）100 (g/mL。大肠杆菌用LB培养，培养基中添加抗生素，终浓度分别为：壮观霉素（Spc）50 (g/mL，氨苄西林(Amp) 50 (g/mL，卡那霉素(Kan) 50 (g/mL。缺失用自杀质粒pSET4s由日本学者Takamatsu馈赠。
1.2 主要试剂
2×PCR Mix、T4 DNA连接酶、限制性内切酶以及DNA Marker购自大连TaKaRa公司。2×Taq酶购自南京博尔迪生物科技有限公司。DNA凝胶回收试剂盒和质粒DNA小量提取试剂盒购自OMEGA公司。LB培养基、酵母浸出物、水解酪蛋白为Oxoid产品。每1 L的LB液体培养基含有10 g胰化蛋白胨、5 g酵母浸出物和10 g NaCl。抗性培养基抗生素终浓度为50 ng/L。固体培养平板为LB或THB液体培养基加入1.5 %琼脂，灭菌后分装到平板。
引物、 DH5α感受态购自鼎国昌盛生物技术有限公司。
2方法
2.1原核表达载体构建
2.1.1 SK基因的扩增
SK基因的扩增
50 μL反应体系：
ddH2O 20 μL
2×PCR mix 25 μL
上游引物Proup 2.0 μL
下游引物Prodown 2.0 μL
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