新猪源干扰素刺激基因（isg）的筛选与功能初步鉴定
：本研究通过NCBI数据库查找猪源基因信息，分析潜在的猪源ISGs基因，通过BALST比对以及生物信息学软件分析不同品种猪的ISGs基因序列的同源性和保守序列，设计扩增目的ISGs的引物，从干扰素作用24h后的PAM细胞中提取总RNA, RT-PCR扩增出目的基因ISG-1056、ISG-3143、ISG-6247和ISG-PPBP。将目的基因与pFlag7.1载体连接，构建重组质粒用于过表达实验。目的ISGs的RNA干扰和基因过表达实验均初步验证了ISG-3143对日本乙型脑炎病毒（JEV）具有抑制作用，ISG-1056、ISG-6247和ISG-PPBP对JEV的作用不显著。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1．1．1 质粒、病毒及细胞2
1．1．2 工具酶与主要试剂2
1．1．3 主要仪器设备2
1．2 实验方法2
1．2．1 猪源ISGs的生物信息学分析2
1．2．2 提取PAM细胞总RNA 3
1．2．3 目的基因的扩增 3
1．2．4 构建ISGs的真核表达载体克隆 5
1．2．5 细胞的传代培养 5
1．2．6 RNA干扰5
1．2．7 目的基因对JEV功能初步检测 6
1．2．8 基因过表达对JEV功能检测 7
2 结果与分析7
2．1 目的基因的扩增7
2．2 重组质粒的酶切鉴定8
2．3 猪源ISGs的功能鉴定10
2．3．1 RNA干扰效率分析 10
2．3．2 目的基因对JEV的功能活性分析 11
2．3．3 基因过表达分析 11
3 讨论 11
致谢12
参考文献12 新猪源干扰素刺激基因（ISG）的筛选与功能初步鉴定
引言
干扰素（IFN）是一种多功能的活性蛋白质，具有广谱的抗病毒、抗肿瘤
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
、促进细胞生长分化、调节免疫等多种生物活性[1]，因此，干扰素是机体重要的蛋白成分之一。在猪病的临床研究中，干扰素表现出良好的抗病毒活性，能够对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒等产生较强的抑制作用[2]，是具有良好应用前景的抗病毒制剂。干扰素并不直接作用于病毒，而是通过诱导机体细胞产生众多的效应分子：干扰素刺激基因（Interferon stimulated gene，ISG），通过这些诱导产生的干扰素刺激基因来实现对病毒的抑制作用[3]。
目前，人源干扰素和干扰素刺激基因的研究较多较全面，在人源干扰素刺激基因（ISG）的研究中发现：不同的病原对不同的干扰素刺激基因有着不同的敏感性，某一个ISG在病原感染宿主的某一个环节发挥特定的作用，而众多的ISGs通过协同机制来发挥抑制病原增殖的作用[4]。在兽医研究领域，猪源ISGs的各方面研究仍然较少，已报道的具有确定序列和功能注释的猪源ISGs有Mx1、ISG15、OAS1和BST2等[59]，这些猪源ISGs均具有抑制某种或某类猪源病毒的作用，均是在病毒感染的某一阶段发挥一定作用，但是现有的这些研究仍十分有限，想要阐明干扰素抗猪源病毒的分子机制，需要我们进一步挖掘和探索更多的未知猪源ISGs。
在对ISG15的研究中发现，ISG15是通过C末端的GlyGly基序与靶蛋白共价结合后再对其进行修饰，这种类似于泛素化现象的结果称为ISG化[10]。ISG化不能降解蛋白，而与应激反应、转录调控和蛋白质翻译等过程密切相关[11]。ISG在病毒感染时发挥作用的机制仍不明确，还需进一步研究。
本课题拟通过新猪源干扰素刺激基因（ISG）的筛选和初步功能鉴定，进一步研究新猪源干扰素刺激基因（ISG）的生物学功能,为阐明干扰素刺激基因的抗病毒作用机制奠定基础。
1 材料与方法
实验材料
1．1．1 质粒、病毒及细胞
质粒Flag7.1载体、PAM细胞、PK15细胞、乙型脑炎病毒（JEV）NJ2008株为本实验室保存。大肠杆菌感受态细胞DH5α购于TaKaRa公司。
1．1．2 工具酶与主要试剂
Q5聚合酶购于New England Biolabs公司。
反转录酶、限制性核酸内切酶购于TaKaRa公司。
T4连接酶购于Thermo Scientific公司。
1640细胞培养基、DMEM细胞培养基、胎牛血清（FBS）购于Gibco公司。
胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒为AXYGEN公司生产。
引物由invitrogen公司合成，测序由invitrogen公司完成。
RNAi oligo分子由上海吉玛生物公司设计和合成。
1．1．3 主要仪器设备
Centrifuge 5417R台式离心机（Eppendorf）
PCR仪（Applied Biosystons）
凝胶成像系统（上海达迈生物科技有限公司）
HZQF160全温振荡培养箱（培英公司）
生物安全柜（Thermo Scientific）
CO2恒温培养箱（Thermo Scientific）
7500 RealTime PCR System（Applied Biosystons）
1．2 实验方法
1．2．1 猪源ISGs的生物信息学分析
通过NCBI数据库查找猪源基因信息，分析可能的猪源ISGs基因。BLAST比对以及生物信息学分析软件分析不同品种猪的ISGs基因序列的同源性和保守序列。Primer 5.0软件设计猪源ISGs基因的扩增引物四组：PPBP、LOC100621056（以下简称“1056”）、LOC100623143（以下简称“3143”）及LOC100626247（以下简称“6247”）。
扩增引物序列、插入酶切位点及目的基因大小如下。
LOC100621056：
上游引物序列：ATAGAATTCATGATTCTTCAGAGGCTCTTCAGACTGTCCT
下游引物序列：TATGGTACCGGACTGTGGTTTTTCGACGGCTT
酶切位点：Hind III/EcoR I
片段大小：342bp
LOC100623143：
上游引物序列：GTGAAGCTTATGTCAGAGTCGACCAGGGATCACAT
下游引物序列：TATGAATTCGGGCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGCCGGCGT
酶切位点：EcoR I/Kpn I
片段大小：510bp
LOC100626247：
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1 实验材料2
1．1．1 质粒、病毒及细胞2
1．1．2 工具酶与主要试剂2
1．1．3 主要仪器设备2
1．2 实验方法2
1．2．1 猪源ISGs的生物信息学分析2
1．2．2 提取PAM细胞总RNA 3
1．2．3 目的基因的扩增 3
1．2．4 构建ISGs的真核表达载体克隆 5
1．2．5 细胞的传代培养 5
1．2．6 RNA干扰5
1．2．7 目的基因对JEV功能初步检测 6
1．2．8 基因过表达对JEV功能检测 7
2 结果与分析7
2．1 目的基因的扩增7
2．2 重组质粒的酶切鉴定8
2．3 猪源ISGs的功能鉴定10
2．3．1 RNA干扰效率分析 10
2．3．2 目的基因对JEV的功能活性分析 11
2．3．3 基因过表达分析 11
3 讨论 11
致谢12
参考文献12 新猪源干扰素刺激基因（ISG）的筛选与功能初步鉴定
引言
干扰素（IFN）是一种多功能的活性蛋白质，具有广谱的抗病毒、抗肿瘤
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
、促进细胞生长分化、调节免疫等多种生物活性[1]，因此，干扰素是机体重要的蛋白成分之一。在猪病的临床研究中，干扰素表现出良好的抗病毒活性，能够对猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒等产生较强的抑制作用[2]，是具有良好应用前景的抗病毒制剂。干扰素并不直接作用于病毒，而是通过诱导机体细胞产生众多的效应分子：干扰素刺激基因（Interferon stimulated gene，ISG），通过这些诱导产生的干扰素刺激基因来实现对病毒的抑制作用[3]。
目前，人源干扰素和干扰素刺激基因的研究较多较全面，在人源干扰素刺激基因（ISG）的研究中发现：不同的病原对不同的干扰素刺激基因有着不同的敏感性，某一个ISG在病原感染宿主的某一个环节发挥特定的作用，而众多的ISGs通过协同机制来发挥抑制病原增殖的作用[4]。在兽医研究领域，猪源ISGs的各方面研究仍然较少，已报道的具有确定序列和功能注释的猪源ISGs有Mx1、ISG15、OAS1和BST2等[59]，这些猪源ISGs均具有抑制某种或某类猪源病毒的作用，均是在病毒感染的某一阶段发挥一定作用，但是现有的这些研究仍十分有限，想要阐明干扰素抗猪源病毒的分子机制，需要我们进一步挖掘和探索更多的未知猪源ISGs。
在对ISG15的研究中发现，ISG15是通过C末端的GlyGly基序与靶蛋白共价结合后再对其进行修饰，这种类似于泛素化现象的结果称为ISG化[10]。ISG化不能降解蛋白，而与应激反应、转录调控和蛋白质翻译等过程密切相关[11]。ISG在病毒感染时发挥作用的机制仍不明确，还需进一步研究。
本课题拟通过新猪源干扰素刺激基因（ISG）的筛选和初步功能鉴定，进一步研究新猪源干扰素刺激基因（ISG）的生物学功能,为阐明干扰素刺激基因的抗病毒作用机制奠定基础。
1 材料与方法
实验材料
1．1．1 质粒、病毒及细胞
质粒Flag7.1载体、PAM细胞、PK15细胞、乙型脑炎病毒（JEV）NJ2008株为本实验室保存。大肠杆菌感受态细胞DH5α购于TaKaRa公司。
1．1．2 工具酶与主要试剂
Q5聚合酶购于New England Biolabs公司。
反转录酶、限制性核酸内切酶购于TaKaRa公司。
T4连接酶购于Thermo Scientific公司。
1640细胞培养基、DMEM细胞培养基、胎牛血清（FBS）购于Gibco公司。
胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒为AXYGEN公司生产。
引物由invitrogen公司合成，测序由invitrogen公司完成。
RNAi oligo分子由上海吉玛生物公司设计和合成。
1．1．3 主要仪器设备
Centrifuge 5417R台式离心机（Eppendorf）
PCR仪（Applied Biosystons）
凝胶成像系统（上海达迈生物科技有限公司）
HZQF160全温振荡培养箱（培英公司）
生物安全柜（Thermo Scientific）
CO2恒温培养箱（Thermo Scientific）
7500 RealTime PCR System（Applied Biosystons）
1．2 实验方法
1．2．1 猪源ISGs的生物信息学分析
通过NCBI数据库查找猪源基因信息，分析可能的猪源ISGs基因。BLAST比对以及生物信息学分析软件分析不同品种猪的ISGs基因序列的同源性和保守序列。Primer 5.0软件设计猪源ISGs基因的扩增引物四组：PPBP、LOC100621056（以下简称“1056”）、LOC100623143（以下简称“3143”）及LOC100626247（以下简称“6247”）。
扩增引物序列、插入酶切位点及目的基因大小如下。
LOC100621056：
上游引物序列：ATAGAATTCATGATTCTTCAGAGGCTCTTCAGACTGTCCT
下游引物序列：TATGGTACCGGACTGTGGTTTTTCGACGGCTT
酶切位点：Hind III/EcoR I
片段大小：342bp
LOC100623143：
上游引物序列：GTGAAGCTTATGTCAGAGTCGACCAGGGATCACAT
下游引物序列：TATGAATTCGGGCTTCCTCTTGGAGAAGATCAGCCGGCGT
酶切位点：EcoR I/Kpn I
片段大小：510bp
LOC100626247：
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/805.html
