和缓艾美耳球虫过氧化物酶基因克隆与表达(附件)
：根据NCBI上公布的和缓艾美耳球虫过氧化物酶(Peroxiredoxin，PRX)基因序列设计一对特异性引物，以和缓艾美耳球虫孢子化卵囊中提取的总RNA为模板，通过RT-PCR克隆PRX基因，构建pET32a-PRX重组质粒，然后将重组质粒转化入E.coli BL21，经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白。对重组质粒测序表明克隆到的PRX基因翻译的氨基酸序列与GenBank中和缓艾美耳球虫过氧化物酶氨基酸序列一致。用DNA Star以及CBS Pediction Servers上的工具对PRX蛋白进行生物信息学分析。结果表明该蛋白存在1个蛋白跨膜区和有2个翻译后修饰位点；进化树分析显示该蛋白与堆型艾美耳球虫PRX基因亲缘性接近。用SDS-PAGE分析重组蛋白的表达情况表明重组蛋白相对分子质量大小约为41.96KD，主要在上清中存在；经过氧化物酶试剂盒检测表明该重组蛋白具有一定酶活性，其酶促反应的最佳温度为30℃，最佳反应pH为8.0。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌种、卵囊和载体质粒 2
1.1.2 工具酶及试剂 2
1.1.3 本实验所用溶液的配置 2
1.1.4 仪器设备 4
1.2 方法 4
1.2.1 总RNA的提取 4
1.2.2 过氧化物酶基因扩增 4
1.2.3 E. mitis过氧化物酶基因原核表达载体的构建 5
1.2.4 E. mitis过氧化物酶测序与序列分析 6
1.2.5 pET32aPRX在BL21大肠杆菌中的微量表达及鉴定 7
1.2.6 表达产物在大肠杆菌中的分布 7
1.2.7 重组蛋白的大量表达 7
1.2.8 重组蛋白的纯化 7
1.2.9 纯化上清的酶活分析 8
2 结果与分析 8
2.1 过氧化物酶基因的克隆 8
2.2 阳性克隆菌液PCR，重组质粒双酶切及PCR结果 9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2.3 过氧化物酶基因的序列分析 9
2.4 过氧化物酶基因的重组蛋白诱导表达 12
2.5 过氧化物酶基因的重组蛋白在E.coli BL21中的分布 12
2.6 过氧化物酶基因的重组蛋白的纯化 12
2.7 重组蛋白的酶活分析 13
3 讨论 13
致谢 15
参考文献 15
和缓艾美耳球虫过氧化物酶基因克隆与表达
引言
鸡球虫病是一种由孢子虫纲艾美耳属球虫引起的鸡的常见疾病，属于鸡场多发病极大危害养鸡业[1]。常见的鸡球虫有七个种，包括柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）、巨型艾美耳球虫（E.maxima）、布氏艾美耳球虫（E.brunetti）、和缓艾美耳球虫（E. mitis）和早熟艾美耳球虫（E.praecox）[1]。有研究使用流行病学的方法对位于江苏的18个鸡场的鸡球虫感染情况进行了调查，发现感染率为66.7%，随后的ITS1PCR检测结果表明感染鸡多呈几种艾美耳球虫混合感染，其中柔嫩艾美耳球虫感染率最高，达91.7%，是江苏地区的优势种，而和缓艾美耳球虫(E. mitis)感染率为50. 0%[2]。和缓艾美尔球虫的致病性相对较弱，但较高的感染率使其依旧存在潜在威胁性。
目前鸡场控制球虫病仍以药物为主，长期用药会导致耐药虫株出现和药物残留问题的产生。鸡感染球虫后可引起鸡对其他病原感染的抵抗力下降或诱导继发其他病原感染，如柔嫩艾美耳球虫感染可以诱导肠炎沙门菌感染[3]。鸡感染球虫后其料肉比下降明显，并可能出现长期带虫的现象。一旦当带虫鸡群与其他鸡群混群饲养容易发生球虫感染的大规模爆发，从而导致养鸡场的巨大损失，限制养鸡业的发展。免疫预防是针对该病的理想方法，随着分子生物学和现代生物技术的发展，基因工程疫苗和DNA 疫苗将会成为未来鸡球虫病控制中的首选[4]。
过氧化物酶(Peroxiredoxin，PRX)属于内源性酶类的抗氧化酶，其功能与常见的过氧化物酶如超氧化物岐化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶相似，虽然PRX催化效率低于前3者至少1个数量级，不过其高敏感性和高亲和力使得PRX能在H2O2处于低浓度时发挥作用[5]。PRX在生物体内主要完成抗氧化和调节H2O2介导细胞内信号通路的作用。现有的研究表明PRX与炎症反应关系密切，还可以发挥分子伴侣功能，与细胞增殖，分化凋亡相关[6]。此外PRX在多种人类癌症发生发展过程中的信号调节作用，使其有望成为一种早期检测癌症的血清标记物[7]。
本实验根据实验室前期研究的结果选取和缓艾美耳球虫过氧化物酶(Peroxiredoxin)基因进行克隆表达研究，为研制有效的控制鸡和缓艾美尔球虫的DNA疫苗进行前期准备，并为鸡球虫的防治工作提供有力的支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种、卵囊和载体质粒
和缓艾美耳球虫孢子化卵囊（由大学动物医学院寄生虫学教研室分离，鉴定，纯化及保存）；E.coli BL21；pET32a/（+）(空载体质粒）由本实验室保存。
1.1.2 工具酶及试剂
OMEGA总RNA提取试剂盒；2×phantaTM Master Mix；oligo dT18(华美公司生产)；胶回收试剂盒和小剂量质粒提取试剂盒（Axygen公司生产）；DL2000 DNA Marker，DL5000 DNA Marker，5×Primer script Buffer，dNTP mix，RNase Inhibitor，Primescript ，限制性内切酶BamHI、HindIII（TaKaRa公司生产）；DEPC（Amresco公司生产）；His Taq亲和层析蛋白纯化柱（GE公司生产）；Thermo蛋白质预染Marker；过氧化物酶试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司，系列号POD2Y）；pH试纸；其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 本实验所用溶液的配置
琼脂糖电泳缓冲液：10×TBE Buffer：称取 Tris 108 g，硼酸55 g，Na2EDTA12H2O 7.44g，加入约 900 mL的去离子水，用磁搅拌器使试剂溶解后定容至1L，室温保存。使用时20倍稀释。
1%琼脂糖凝胶：称取 0.3 g琼脂糖，加入30 mL 0.5×TBE Buffer，微波炉煮沸至完全溶解，冷却约至50 ℃倒入插好梳子模具中，根据实际需要调整凝胶的总量和模具。
氨苄青霉素(Amp)：称取 2.5g Ampicillin 置于50 mL离心管中，在超净台中加入20 mL灭菌蒸馏水，充分溶解震荡混匀后，定容至25 mL。用高压过得0.22 μm滤膜过滤配好的溶液从而除去菌以及杂质，用2mL的EP管每管1.5mL分装后，装入塑封袋，表明试剂名称和日期，20 ℃冻存备用。
LB(LuriaBertani)培养基
LB液体培养基：将10 gTRYPTONE，5gYEAST EXTRACT，10 gNaCl 加入约800 mL去离子水中，充分搅拌溶解，定容至1L，根据需要分装到不同规格的容器中，常规高压灭菌后，4 ℃保存备用。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 材料 2
1.1.1 菌种、卵囊和载体质粒 2
1.1.2 工具酶及试剂 2
1.1.3 本实验所用溶液的配置 2
1.1.4 仪器设备 4
1.2 方法 4
1.2.1 总RNA的提取 4
1.2.2 过氧化物酶基因扩增 4
1.2.3 E. mitis过氧化物酶基因原核表达载体的构建 5
1.2.4 E. mitis过氧化物酶测序与序列分析 6
1.2.5 pET32aPRX在BL21大肠杆菌中的微量表达及鉴定 7
1.2.6 表达产物在大肠杆菌中的分布 7
1.2.7 重组蛋白的大量表达 7
1.2.8 重组蛋白的纯化 7
1.2.9 纯化上清的酶活分析 8
2 结果与分析 8
2.1 过氧化物酶基因的克隆 8
2.2 阳性克隆菌液PCR，重组质粒双酶切及PCR结果 9
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
2.3 过氧化物酶基因的序列分析 9
2.4 过氧化物酶基因的重组蛋白诱导表达 12
2.5 过氧化物酶基因的重组蛋白在E.coli BL21中的分布 12
2.6 过氧化物酶基因的重组蛋白的纯化 12
2.7 重组蛋白的酶活分析 13
3 讨论 13
致谢 15
参考文献 15
和缓艾美耳球虫过氧化物酶基因克隆与表达
引言
鸡球虫病是一种由孢子虫纲艾美耳属球虫引起的鸡的常见疾病，属于鸡场多发病极大危害养鸡业[1]。常见的鸡球虫有七个种，包括柔嫩艾美耳球虫（E.tenella）、毒害艾美耳球虫（E.necatrix）、堆型艾美耳球虫（E.acervulina）、巨型艾美耳球虫（E.maxima）、布氏艾美耳球虫（E.brunetti）、和缓艾美耳球虫（E. mitis）和早熟艾美耳球虫（E.praecox）[1]。有研究使用流行病学的方法对位于江苏的18个鸡场的鸡球虫感染情况进行了调查，发现感染率为66.7%，随后的ITS1PCR检测结果表明感染鸡多呈几种艾美耳球虫混合感染，其中柔嫩艾美耳球虫感染率最高，达91.7%，是江苏地区的优势种，而和缓艾美耳球虫(E. mitis)感染率为50. 0%[2]。和缓艾美尔球虫的致病性相对较弱，但较高的感染率使其依旧存在潜在威胁性。
目前鸡场控制球虫病仍以药物为主，长期用药会导致耐药虫株出现和药物残留问题的产生。鸡感染球虫后可引起鸡对其他病原感染的抵抗力下降或诱导继发其他病原感染，如柔嫩艾美耳球虫感染可以诱导肠炎沙门菌感染[3]。鸡感染球虫后其料肉比下降明显，并可能出现长期带虫的现象。一旦当带虫鸡群与其他鸡群混群饲养容易发生球虫感染的大规模爆发，从而导致养鸡场的巨大损失，限制养鸡业的发展。免疫预防是针对该病的理想方法，随着分子生物学和现代生物技术的发展，基因工程疫苗和DNA 疫苗将会成为未来鸡球虫病控制中的首选[4]。
过氧化物酶(Peroxiredoxin，PRX)属于内源性酶类的抗氧化酶，其功能与常见的过氧化物酶如超氧化物岐化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶相似，虽然PRX催化效率低于前3者至少1个数量级，不过其高敏感性和高亲和力使得PRX能在H2O2处于低浓度时发挥作用[5]。PRX在生物体内主要完成抗氧化和调节H2O2介导细胞内信号通路的作用。现有的研究表明PRX与炎症反应关系密切，还可以发挥分子伴侣功能，与细胞增殖，分化凋亡相关[6]。此外PRX在多种人类癌症发生发展过程中的信号调节作用，使其有望成为一种早期检测癌症的血清标记物[7]。
本实验根据实验室前期研究的结果选取和缓艾美耳球虫过氧化物酶(Peroxiredoxin)基因进行克隆表达研究，为研制有效的控制鸡和缓艾美尔球虫的DNA疫苗进行前期准备，并为鸡球虫的防治工作提供有力的支持。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种、卵囊和载体质粒
和缓艾美耳球虫孢子化卵囊（由大学动物医学院寄生虫学教研室分离，鉴定，纯化及保存）；E.coli BL21；pET32a/（+）(空载体质粒）由本实验室保存。
1.1.2 工具酶及试剂
OMEGA总RNA提取试剂盒；2×phantaTM Master Mix；oligo dT18(华美公司生产)；胶回收试剂盒和小剂量质粒提取试剂盒（Axygen公司生产）；DL2000 DNA Marker，DL5000 DNA Marker，5×Primer script Buffer，dNTP mix，RNase Inhibitor，Primescript ，限制性内切酶BamHI、HindIII（TaKaRa公司生产）；DEPC（Amresco公司生产）；His Taq亲和层析蛋白纯化柱（GE公司生产）；Thermo蛋白质预染Marker；过氧化物酶试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司，系列号POD2Y）；pH试纸；其余试剂均为国产分析纯。
1.1.3 本实验所用溶液的配置
琼脂糖电泳缓冲液：10×TBE Buffer：称取 Tris 108 g，硼酸55 g，Na2EDTA12H2O 7.44g，加入约 900 mL的去离子水，用磁搅拌器使试剂溶解后定容至1L，室温保存。使用时20倍稀释。
1%琼脂糖凝胶：称取 0.3 g琼脂糖，加入30 mL 0.5×TBE Buffer，微波炉煮沸至完全溶解，冷却约至50 ℃倒入插好梳子模具中，根据实际需要调整凝胶的总量和模具。
氨苄青霉素(Amp)：称取 2.5g Ampicillin 置于50 mL离心管中，在超净台中加入20 mL灭菌蒸馏水，充分溶解震荡混匀后，定容至25 mL。用高压过得0.22 μm滤膜过滤配好的溶液从而除去菌以及杂质，用2mL的EP管每管1.5mL分装后，装入塑封袋，表明试剂名称和日期，20 ℃冻存备用。
LB(LuriaBertani)培养基
LB液体培养基：将10 gTRYPTONE，5gYEAST EXTRACT，10 gNaCl 加入约800 mL去离子水中，充分搅拌溶解，定容至1L，根据需要分装到不同规格的容器中，常规高压灭菌后，4 ℃保存备用。
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