苏淮猪耐粗饲的肠道微生物特征初步解析
研究猪耐粗饲特性可为猪生产开发新型饲料资源，在一定程度上缓解人猪争粮矛盾，降低饲料成本，同时可补充生猪生长所需的维生素和矿物元素。粗纤维在猪生产上有重要作用，能为猪提供能量、改善动物福利、促进机体健康以及提高母猪繁殖性能。猪肠道内的纤维降解主要来自微生物的发酵，因此，肠道内纤维降解微生物的研究就成为近年来解析地方猪耐粗饲机制的一个研究热点和重要方向。苏淮猪是我国自主培育的具有耐粗特性的新品种，为解析其耐粗的肠道微生物机制，本试验使用real-time PCR技术，研究了高、低纤维消化率苏淮猪结肠内产琥珀酸丝状菌、白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌等三种常见纤维分解菌的丰度差异，并分析这些微生物的丰度与纤维表观消化率的相关性。结果表明，产琥珀酸丝状菌、白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的丰度在高、低纤维消化率组间均无显著差异（P>0.05）。同时相关性分析也发现，三种纤维分解菌的微生物丰度与纤维表观消化率间均无显著相关性（P＞0.05）。由此可见，结肠产琥珀酸丝状菌、白化瘤胃球菌和柔嫩梭菌的丰度与苏淮猪粗纤维的消化率无显著相关，下一步需要寻找其它未知的与苏淮猪粗纤维表观消化率相关的纤维分解菌。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法5
1.1试验设计5
1.2日粮及饲养管理5
1.3样品采集5
1.4筛选5
1.5主要试验仪器5
2肠道纤维分解菌数量测定5
2.1 DNA提取5
2.2 DNA电泳检测5
2.3引物设计6
2.4目的片段PCR扩增条件的摸索6
2.5细菌标准品的制备6
2.5.1 PCR扩增6
2.5.2 利用凝胶电泳技术对扩增结果进行检测6
2.5.3 PCR产物片段纯化7
2.5.4 Vector载体链接与目的7
2.5.5 质粒的提取7
2.5.6 Realtime PCR检测内容物中相关微生物数量7
3数据统计与分析7
4结果与分析7
4.1凝胶电泳检测 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
PCR扩增电泳图8
4.2标准曲线8
4.3高低纤维消化组的微生物丰度差异性分析9
4.4微生物丰度与纤维消化率的相关性分析10
4.5 8月龄高、低纤维消化率组的微生物丰度差异性分析 10
4.6 8月龄苏淮猪微生物丰度与纤维消化率的相关性分析11
5讨论12
6小结13
致谢13
参考文献13
苏淮猪耐粗饲的肠道微生物特征初步解析?
引言
肠道微生物是人以及动物重要的“器官”，它与机体免疫、营养和代谢等诸多生理功能紧密相关，健康的宿主与肠道微生物之间共栖共生着稳态的平衡关系，但一旦平衡被打破，就会诱发多种疾病。
肠道微生物消化纤维是一个连续有机的过程，首先微生物通过附着、粘连和穿透等一系列作用与粗纤维结合，然后分泌各种酶类将纤维的各组分加以水解。猪胃和小肠不能产生降解日粮纤维的酶，消化吸收粗纤维主要通过其大肠中微生物如黄化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、白化瘤胃球菌（Ruminococcus albus）和产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）等的降解作用来实现[1]。大肠微生物，尤其是纤维分解菌分泌的纤维素酶复合体，将纤维作为发酵底物，水解纤维素聚合体，产生单糖或寡糖，再经发酵产生乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA），最终被机体吸收利用，其中结肠中VFA可为生长猪提供528%的能量[2]。
本试验研究动物苏淮猪是1998年开始，利用含有淮猪血缘的新淮猪与瘦肉型大白猪杂交选育而成的的新品种。苏淮猪既保留了淮猪的耐粗饲、抗病力强的特性，又吸纳了大白猪生长快、瘦肉多的优点，且是节粮瘦肉型猪新品种。苏淮母猪的节能特点表现为在一个生产周期（空怀、怀孕、哺乳=164d）内，用较低的消化能（DE）（只有瘦肉型母猪饲养标准的86.06%)饲养，仍能正常生长和产仔。一头母猪一年节省的饲料能量相当于117.6kg玉米。因此苏淮猪推广可为解决我国粮食安全问题，发展节粮型养猪业提供重要支撑。然而目前苏淮猪耐粗饲的肠道微生物机制尚未清楚，系统研究以苏淮猪耐粗饲的机理，可为解析我国地方猪种耐粗饲机理奠定基础，为培育具有耐粗特性的新猪种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验设计
选择健康苏淮育肥猪。选取出生条件相近苏淮猪，在相同饲养环境下饲养，在7或8月龄时进行屠宰，采集肠道内容物样品，并用10%稀硫酸进行混合处理，测定结肠后段各营养成分的表观消化率，从中选取高纤维消化率组和低纤维消化率组进行肠道微生物realtime qPCR试验。饲养试验在江苏省淮阴种猪场进行。饲料均未添加抗生素等。
1.2 日粮及饲养管理
试验猪每日饲喂2次，时间分别为上午8:309:30和下午2:303:30。试验过程采用干料饲喂，饲喂时间段自由饮食，全天自由饮水，日常管理与防疫按照场内生产常规进行。
1.3样品采集
饲养验结束后，空腹四小时全部屠宰，自由饮水。宰杀时实行宰前电击晕法，然后采用颈部大血管放血法。收集其肠道内容物，于灭菌离心管中。
1.4筛选
营养物质的表观消化率测定方法见张文杰的毕业论文，根据表观消化率数据，从中选择粗纤维消化率最高的10头猪的粪样、最低的10头猪的粪样，进行测定。
1.5主要试验仪器
高压灭菌消毒锅：上海申安医疗器械厂；恒温水浴锅：北京医疗设备厂；梯度PCR扩增仪：美国ABI公司；超净工作台：上海博讯实业有限公司；DYYIII2稳压电泳仪：北京六一仪器厂；凝胶成像仪：美国BIORAD伯乐公司；实时荧光定量PCR仪：ABI7300，美国ABI公司；低温高速离心机(Centrifuge 581 OR)：美国Thermo公司；可调式微量移液器：美国Thermo公司；紫外分光光度计额国Thermo公司；千分之一电子天平：德国俄公司；定时恒温谔谔搅拌器：上海沪西分析仪器厂。
2 肠道纤维分解菌数量测定
2.1 DNA提取
利用TIANamp Stool DNA Kit(DP328)提取DNA,提取结肠内容物DNA，将DNA原液稀释至5ng/μl备用。
2.2 DNA电泳检测
根据制胶槽的大小，取一定量的琼脂糖。置于三角瓶中，加入 0.5×TBE。三角瓶口上倒扣一个小烧杯，在电炉上加热使琼脂糖溶解，冷却至 70℃，加入GoldView，混匀后倒入已插好梳子的制胶槽，厚度为 3～5mm。
等完全凝固，放在电泳槽中，加入 0.5×TBE，液高于胶面 1 mm。
样品液和 DNA Marker 各 5μL，各加入 1μL 溴酚蓝指示剂，混匀，用移液枪加入样品孔中。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言4
1材料与方法5
1.1试验设计5
1.2日粮及饲养管理5
1.3样品采集5
1.4筛选5
1.5主要试验仪器5
2肠道纤维分解菌数量测定5
2.1 DNA提取5
2.2 DNA电泳检测5
2.3引物设计6
2.4目的片段PCR扩增条件的摸索6
2.5细菌标准品的制备6
2.5.1 PCR扩增6
2.5.2 利用凝胶电泳技术对扩增结果进行检测6
2.5.3 PCR产物片段纯化7
2.5.4 Vector载体链接与目的7
2.5.5 质粒的提取7
2.5.6 Realtime PCR检测内容物中相关微生物数量7
3数据统计与分析7
4结果与分析7
4.1凝胶电泳检测 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
PCR扩增电泳图8
4.2标准曲线8
4.3高低纤维消化组的微生物丰度差异性分析9
4.4微生物丰度与纤维消化率的相关性分析10
4.5 8月龄高、低纤维消化率组的微生物丰度差异性分析 10
4.6 8月龄苏淮猪微生物丰度与纤维消化率的相关性分析11
5讨论12
6小结13
致谢13
参考文献13
苏淮猪耐粗饲的肠道微生物特征初步解析?
引言
肠道微生物是人以及动物重要的“器官”，它与机体免疫、营养和代谢等诸多生理功能紧密相关，健康的宿主与肠道微生物之间共栖共生着稳态的平衡关系，但一旦平衡被打破，就会诱发多种疾病。
肠道微生物消化纤维是一个连续有机的过程，首先微生物通过附着、粘连和穿透等一系列作用与粗纤维结合，然后分泌各种酶类将纤维的各组分加以水解。猪胃和小肠不能产生降解日粮纤维的酶，消化吸收粗纤维主要通过其大肠中微生物如黄化瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）、白化瘤胃球菌（Ruminococcus albus）和产琥珀酸丝状杆菌（Fibrobacter succinogenes）等的降解作用来实现[1]。大肠微生物，尤其是纤维分解菌分泌的纤维素酶复合体，将纤维作为发酵底物，水解纤维素聚合体，产生单糖或寡糖，再经发酵产生乙酸、丙酸和丁酸等挥发性脂肪酸（volatile fatty acids, VFA），最终被机体吸收利用，其中结肠中VFA可为生长猪提供528%的能量[2]。
本试验研究动物苏淮猪是1998年开始，利用含有淮猪血缘的新淮猪与瘦肉型大白猪杂交选育而成的的新品种。苏淮猪既保留了淮猪的耐粗饲、抗病力强的特性，又吸纳了大白猪生长快、瘦肉多的优点，且是节粮瘦肉型猪新品种。苏淮母猪的节能特点表现为在一个生产周期（空怀、怀孕、哺乳=164d）内，用较低的消化能（DE）（只有瘦肉型母猪饲养标准的86.06%)饲养，仍能正常生长和产仔。一头母猪一年节省的饲料能量相当于117.6kg玉米。因此苏淮猪推广可为解决我国粮食安全问题，发展节粮型养猪业提供重要支撑。然而目前苏淮猪耐粗饲的肠道微生物机制尚未清楚，系统研究以苏淮猪耐粗饲的机理，可为解析我国地方猪种耐粗饲机理奠定基础，为培育具有耐粗特性的新猪种提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验设计
选择健康苏淮育肥猪。选取出生条件相近苏淮猪，在相同饲养环境下饲养，在7或8月龄时进行屠宰，采集肠道内容物样品，并用10%稀硫酸进行混合处理，测定结肠后段各营养成分的表观消化率，从中选取高纤维消化率组和低纤维消化率组进行肠道微生物realtime qPCR试验。饲养试验在江苏省淮阴种猪场进行。饲料均未添加抗生素等。
1.2 日粮及饲养管理
试验猪每日饲喂2次，时间分别为上午8:309:30和下午2:303:30。试验过程采用干料饲喂，饲喂时间段自由饮食，全天自由饮水，日常管理与防疫按照场内生产常规进行。
1.3样品采集
饲养验结束后，空腹四小时全部屠宰，自由饮水。宰杀时实行宰前电击晕法，然后采用颈部大血管放血法。收集其肠道内容物，于灭菌离心管中。
1.4筛选
营养物质的表观消化率测定方法见张文杰的毕业论文，根据表观消化率数据，从中选择粗纤维消化率最高的10头猪的粪样、最低的10头猪的粪样，进行测定。
1.5主要试验仪器
高压灭菌消毒锅：上海申安医疗器械厂；恒温水浴锅：北京医疗设备厂；梯度PCR扩增仪：美国ABI公司；超净工作台：上海博讯实业有限公司；DYYIII2稳压电泳仪：北京六一仪器厂；凝胶成像仪：美国BIORAD伯乐公司；实时荧光定量PCR仪：ABI7300，美国ABI公司；低温高速离心机(Centrifuge 581 OR)：美国Thermo公司；可调式微量移液器：美国Thermo公司；紫外分光光度计额国Thermo公司；千分之一电子天平：德国俄公司；定时恒温谔谔搅拌器：上海沪西分析仪器厂。
2 肠道纤维分解菌数量测定
2.1 DNA提取
利用TIANamp Stool DNA Kit(DP328)提取DNA,提取结肠内容物DNA，将DNA原液稀释至5ng/μl备用。
2.2 DNA电泳检测
根据制胶槽的大小，取一定量的琼脂糖。置于三角瓶中，加入 0.5×TBE。三角瓶口上倒扣一个小烧杯，在电炉上加热使琼脂糖溶解，冷却至 70℃，加入GoldView，混匀后倒入已插好梳子的制胶槽，厚度为 3～5mm。
等完全凝固，放在电泳槽中，加入 0.5×TBE，液高于胶面 1 mm。
样品液和 DNA Marker 各 5μL，各加入 1μL 溴酚蓝指示剂，混匀，用移液枪加入样品孔中。
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