氧化应激处理小鼠卵巢中parp1的激活与解离特征研究
在畜牧生产过程中，环境或营养方面的因素均会引起动物的氧化应激，进而影响到卵泡的发育及闭锁过程，进而影响到动物的繁殖力，基于此，研究哺乳动物氧化应激条件下卵泡闭锁的机制对于畜牧生产具有重要的应用意义，不仅可为畜牧生产中提高家畜繁殖力提供有价值的参考依据，而且可能对治疗人类的不育提供解决方案。因此，本研究将应用免疫组化，Western blot等技术初步探究氧化应激对卵泡发育及闭锁的影响以及PARP-1在上述过程中的作用。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words 2
引言2
缩略词2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 5
1.2.1小鼠处理4
1.2.2抗氧化酶活性测定4
1.2.3免疫组织化学测定4
1.2.4蛋白印迹测定4
1.2.5卵巢组织形态学观察4
2 结果与分析5
2.1 3NPA对卵巢的抗氧化物酶活性的影响5
2.2 免疫组化检测氧化应激小鼠卵巢中PARP1和裂解的PARP1 5
2.3 westernblot蛋白印迹检测6
2.4 卵巢组织形态学观察6
3 讨论7
致谢7
参考文献8
氧化应激处理小鼠卵巢中PARP1的激活与解离特征研究
引言
对于性成熟的雌性哺乳动物来说，每一个发情周期过程中，卵巢中均有大量卵泡启动生长。然而，由于生理病理原因或环境影响，仅少数卵泡发育成熟至排卵，大部分（超过95%）的卵泡终将闭锁。这一现象普遍存在于人、猪、牛、羊、大鼠、以及小鼠等哺乳动物中[13]。其中，活性氧在哺乳动物雌性生殖及相关疾病中扮演主导角色。内源性活性氧作为分子信号参与大多数动物生殖生理功能，包括卵母细胞的成熟、卵巢激素的调节、排卵、着床、囊胚形成、黄体溶解和黄体维持【4,5】。然而，活性氧的过度激活可以打破氧化抗氧化系统的平衡，导致组织的不良影响，一种被称为氧化应激（OS），包括脂质损伤作用，抑制蛋白质的合成以及ATP耗竭[6]，最近的研究表明，氧化应激在女性
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的整个生殖活动中都扮演了非常重要的角色，例如，致使与年龄增长有关的生育率下降，妊娠晚期或临产后子痫症的发作，葡萄胎、自由基引起的出生缺陷,甚至流产等等。
聚ADP核糖聚合酶(poly ADPribose polymerase, PARP)是一类NAD+依赖性且存在于大多数真核细胞内的蛋白质翻译后修饰酶。作为该家族的主要成员，PARP1在细胞内多种生命活动过程中起着重要作用，包活DNA修复、基因组稳定性维持、基因毒性应激。越来越多的研究发现PARP1参与动物的多种生理或病理过程。近期，研究室在个体水平和细胞水平的研究数据表明PARP1参与了猪卵泡闭锁的过程[710] （相关数据分别发表在Reproduction和Animal Reproduction Science），但氧化应激过程中小鼠卵巢PARP1的激活与解离特征未见报道。
本项研究采用小鼠腹腔注射3硝基丙酸（3NPA）为模型，采用免疫组化，Western blot和RTPCR技术探讨3NPA在诱导卵巢细胞凋亡过程中发挥的作用以及PARP1于氧化应激小鼠卵巢中的激活与解离特征。
缩略词（Abbreviation）
英文缩写
英文全称
中文全称
PARP1
poly ADPribose polymerase1
聚ADP核糖聚合酶1
3NPA
3nitropropionic acid
3硝基丙酸
ROS
Reactive Oxygen Species
活性氧簇
OS
oxidative stress
氧化应激
TSOD
superoxide dismutase?
超氧化物歧化酶
GSHPX
glutathione peroxidase
谷胱甘肽过氧化物酶
CAT
catalase
过氧化氢酶
SDH
Succinatedehydrogenase
琥珀酸脱氢酶
PBS
Phosphate Buffered Saline
磷酸盐缓冲液
SDSPAGE
sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
GC
granulosa cells
卵巢颗粒细胞
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1主要试剂
3,3 二氨基联苯胺（DAB）（西格玛–奥德里奇，路易斯，美国）
兔antiparp1抗体h250卵巢组织（圣克鲁斯，加利福尼亚，美国）
Anti PARP1抗体 （cleaved p25)（圣迭戈，美国）
3硝基丙酸（3NPA，> 97%纯度，CAS号000079061）
SOD、GSHPX、CAT商业试剂盒（碧云天，南通，中国）
RIPA裂解缓冲液（碧云天公司，南通，中国）
BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司，南通，中国）
所有化学试剂均为采购试剂级。
1.1.2 动物材料
三周龄ICR雌性小鼠60只，平均体重在22g与25g之间，从南京市青龙山实验动物中心购买。
1.2 方法
1.2.1小鼠处理
六十只三周龄小鼠饲养在人工控温室（22–24℃）和人工光照（14 h光照，10 h黑暗）条件下，标准颗粒饲料饲喂，自由饮水和采食，进行7d的标准化饲养，以调节生理周期，适应环境，供实验使用。然后随机分为三组（n = 20）
①对照组， 0.1mL生理盐水腹腔注射
②3NPA低剂量组（25 mg/kg）0.1ml，使用生理盐水稀释、PH调为7.4腹腔注射
③3NPA高剂量组(50 mg/kg)0.1ml，使用生理盐水稀释、PH调为7.4腹腔注射
间隔24小时连续注射10d。
每日记录体重增加量，第十天小鼠经乙醚吸入麻醉，颈部脱臼处死，收集双侧卵巢；计算卵巢质量指数： 卵巢重/体重×100%
两侧卵巢一侧用于抗氧化酶分析和分子分析，另一侧固定于4%多聚甲醛溶液中，经脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡至水等步骤用于形态学分析。
1.2.2抗氧化酶活性测定
冷生理盐水为介质制作卵巢匀浆及肝匀浆，进行抗氧化酶活性的测定。采用SOD、GSHPX、CAT商业试剂盒测定（南京建成生物工程研究所，南京，中国）。SOD和GPX活性表示为每毫克蛋白单位（U／mg蛋白）。CAT的活动被表示为（U/g蛋白）。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words 2
引言2
缩略词2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.2方法 5
1.2.1小鼠处理4
1.2.2抗氧化酶活性测定4
1.2.3免疫组织化学测定4
1.2.4蛋白印迹测定4
1.2.5卵巢组织形态学观察4
2 结果与分析5
2.1 3NPA对卵巢的抗氧化物酶活性的影响5
2.2 免疫组化检测氧化应激小鼠卵巢中PARP1和裂解的PARP1 5
2.3 westernblot蛋白印迹检测6
2.4 卵巢组织形态学观察6
3 讨论7
致谢7
参考文献8
氧化应激处理小鼠卵巢中PARP1的激活与解离特征研究
引言
对于性成熟的雌性哺乳动物来说，每一个发情周期过程中，卵巢中均有大量卵泡启动生长。然而，由于生理病理原因或环境影响，仅少数卵泡发育成熟至排卵，大部分（超过95%）的卵泡终将闭锁。这一现象普遍存在于人、猪、牛、羊、大鼠、以及小鼠等哺乳动物中[13]。其中，活性氧在哺乳动物雌性生殖及相关疾病中扮演主导角色。内源性活性氧作为分子信号参与大多数动物生殖生理功能，包括卵母细胞的成熟、卵巢激素的调节、排卵、着床、囊胚形成、黄体溶解和黄体维持【4,5】。然而，活性氧的过度激活可以打破氧化抗氧化系统的平衡，导致组织的不良影响，一种被称为氧化应激（OS），包括脂质损伤作用，抑制蛋白质的合成以及ATP耗竭[6]，最近的研究表明，氧化应激在女性
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ￥351916072$
的整个生殖活动中都扮演了非常重要的角色，例如，致使与年龄增长有关的生育率下降，妊娠晚期或临产后子痫症的发作，葡萄胎、自由基引起的出生缺陷,甚至流产等等。
聚ADP核糖聚合酶(poly ADPribose polymerase, PARP)是一类NAD+依赖性且存在于大多数真核细胞内的蛋白质翻译后修饰酶。作为该家族的主要成员，PARP1在细胞内多种生命活动过程中起着重要作用，包活DNA修复、基因组稳定性维持、基因毒性应激。越来越多的研究发现PARP1参与动物的多种生理或病理过程。近期，研究室在个体水平和细胞水平的研究数据表明PARP1参与了猪卵泡闭锁的过程[710] （相关数据分别发表在Reproduction和Animal Reproduction Science），但氧化应激过程中小鼠卵巢PARP1的激活与解离特征未见报道。
本项研究采用小鼠腹腔注射3硝基丙酸（3NPA）为模型，采用免疫组化，Western blot和RTPCR技术探讨3NPA在诱导卵巢细胞凋亡过程中发挥的作用以及PARP1于氧化应激小鼠卵巢中的激活与解离特征。
缩略词（Abbreviation）
英文缩写
英文全称
中文全称
PARP1
poly ADPribose polymerase1
聚ADP核糖聚合酶1
3NPA
3nitropropionic acid
3硝基丙酸
ROS
Reactive Oxygen Species
活性氧簇
OS
oxidative stress
氧化应激
TSOD
superoxide dismutase?
超氧化物歧化酶
GSHPX
glutathione peroxidase
谷胱甘肽过氧化物酶
CAT
catalase
过氧化氢酶
SDH
Succinatedehydrogenase
琥珀酸脱氢酶
PBS
Phosphate Buffered Saline
磷酸盐缓冲液
SDSPAGE
sodium dodecyl sulfatepolyacrylamide gel electrophoresis
十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳
GC
granulosa cells
卵巢颗粒细胞
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1主要试剂
3,3 二氨基联苯胺（DAB）（西格玛–奥德里奇，路易斯，美国）
兔antiparp1抗体h250卵巢组织（圣克鲁斯，加利福尼亚，美国）
Anti PARP1抗体 （cleaved p25)（圣迭戈，美国）
3硝基丙酸（3NPA，> 97%纯度，CAS号000079061）
SOD、GSHPX、CAT商业试剂盒（碧云天，南通，中国）
RIPA裂解缓冲液（碧云天公司，南通，中国）
BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天公司，南通，中国）
所有化学试剂均为采购试剂级。
1.1.2 动物材料
三周龄ICR雌性小鼠60只，平均体重在22g与25g之间，从南京市青龙山实验动物中心购买。
1.2 方法
1.2.1小鼠处理
六十只三周龄小鼠饲养在人工控温室（22–24℃）和人工光照（14 h光照，10 h黑暗）条件下，标准颗粒饲料饲喂，自由饮水和采食，进行7d的标准化饲养，以调节生理周期，适应环境，供实验使用。然后随机分为三组（n = 20）
①对照组， 0.1mL生理盐水腹腔注射
②3NPA低剂量组（25 mg/kg）0.1ml，使用生理盐水稀释、PH调为7.4腹腔注射
③3NPA高剂量组(50 mg/kg)0.1ml，使用生理盐水稀释、PH调为7.4腹腔注射
间隔24小时连续注射10d。
每日记录体重增加量，第十天小鼠经乙醚吸入麻醉，颈部脱臼处死，收集双侧卵巢；计算卵巢质量指数： 卵巢重/体重×100%
两侧卵巢一侧用于抗氧化酶分析和分子分析，另一侧固定于4%多聚甲醛溶液中，经脱水、浸蜡、包埋、切片、脱蜡至水等步骤用于形态学分析。
1.2.2抗氧化酶活性测定
冷生理盐水为介质制作卵巢匀浆及肝匀浆，进行抗氧化酶活性的测定。采用SOD、GSHPX、CAT商业试剂盒测定（南京建成生物工程研究所，南京，中国）。SOD和GPX活性表示为每毫克蛋白单位（U／mg蛋白）。CAT的活动被表示为（U/g蛋白）。
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