猪13号染色体基因位点rs81447100与二花脸猪苏太猪产仔数关联性分析
摘 要猪产仔数是猪重要的经济性状,如果能提高猪的产仔性能，将给现代养猪业带来可观的经济效益。然而，产仔数受复杂多基因控制，遗传力低，传统选育方法提高猪产仔数难度较大，因此开发和利用新的分子选育标记来提高猪的产仔数成为研究的热点。本研究采用PCR扩增技术与DNA测序技术对181头纯种二花脸猪和173头含二花脸血统的苏太猪的DNA的特异位点rs81447100进行测序分析，并对测序结果与其产仔数之间的关联性进行分析。结果显示181头纯种二花脸猪群体中rs81447100 T/C位点的三种基因型产仔数差异均不显著；173头苏太猪群体中，rs81447100T/C位点的CC基因型经产产活仔数显著高于TT基因型（P < 0.05），CC基因型个体经产产活仔数每窝平均增加0.89头。由此可见，rs81447100T/C位点可作为进一步选育苏太猪的标记。关键字二花脸猪；苏太猪；rs81447100位点；产仔数；关联性Association study of pig litter size with the chromosome 13 loci rs81447100 of Erhualian pig and Sutai pigStudent majoring in Animal Science Zhao MoranTutor Huang Ruihua & Li PinghuaAbstract: Litter size is an important index. Improvement of litter size will bring enormous economic benefits in pig industry. However, litter size is affected by polygenics with a low heritability. The traditional breeding methods are difficult for improving litter size. It becomes a hot research topic to develop and utilize the molecular breeding method to improve litter size of pig. This research *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
analyzed the DNA sequencing of rs81447100, the specific locus on the DNA from 181 Erhualian pigs and 173 Sutai pigs which contain Erhualians’ descent, and then analyzed the association between the genotypes and the litter size record. The result showed thatThere was no significant difference of litter size among the 181 Erhualian pigs with TT genotype of rs81447100T/C loci, TC genotype and CC genotype. In the 173 Sutai pigs, litter size from 2 to 7 parity of CC genotype of rs81447100 T/C loci significantly higher than that of TT genotype (P < 0.05). The multiparity litter size of CC genotype increased by an average of 0.89. So as a result, rs81447100 T/C loci can be the mark of further breeding for Sutai pig .Key words: Erhualian pig; Sutai pig; loci rs81447100; litter size; association产仔数是猪最为重要的经济性状，如果能提高猪的产仔性能，将直接影响猪的生产效率，给现代养猪业带来可观的经济效益。二花脸猪是国家级畜禽遗传资源保护品种，以性成熟早、繁殖力高、产仔多、母性好等优良特性而闻名于世[1]；曾创造窝总产仔数42头的世界最高单胎产仔纪录[2]，是优秀的遗传资源；研究其高繁殖特性以提高其商品猪的产仔性能，对我国养猪业的发展具有重要意义。母猪繁殖力的高低, 主要取决于母猪本身的遗传基础[1]。产仔数受复杂多基因控制，遗传力很低，采用传统的选育技术提高猪产仔数进展较慢[3]，近些年通过分子育种新技术提高猪的繁殖性能倍受重视，其中候选基因法与定位数量性状基因位点（QTL）法是研究者关注的重点，尽管产仔数相关候选基因或QTL报道较多，但二花脸猪高产的遗传机理尚不清楚。在候选基因方面，鉴别的影响产仔数的候选基因较多[4]，包括报道较多的ESR、FSHβ、RARG、RBP4、PRLR和OPN等基因，但这些基因位点通常只在特定的群体存在关联性[5,6]。在QTL定位方面，从国际猪QTL数据库可知，目前已成功定位了616个与产仔数相关的QTL，其中报道的与二花脸或太湖流域地方猪种产仔数相关的QTL主要定位于1、5、6、7、8、12、13和15号染色体。表1 二花脸产仔数极端高、低产组间产仔数差异性分析结果Table1. Difference analysis of Erhualian pigs between high and low level组别个体数育种值总产仔数产活仔数Top 12%250.87016.54±0.28A15.66±0.24ABottom 12%25-1.17212.90±0.27B12.37±0.26B注 A，B表示差异达极显著水平，即P < 0.01图1 二花脸高、低产群体经产产活仔数GWAS分析结果Figure 1 GWAS analysis of number born alive (NBA) of multiparity Erhualian pigs between high and low level1 材料与方法1.1试验材料本研究的实验材料猪耳组织样品采集于两个不同猪场。其中109头纯种二花脸母猪来自于江苏常熟二花脸国家保种场，另72头纯种二花脸母猪和173头含二花脸血统的苏太母猪来自于江苏苏太企业有限公司猪场，并从两场获得这些母猪的繁殖记录。 样品采集后被装入含75%酒精的离心管，置于-20℃冰箱内保存备用。1.2 试验方法1.2.1 样品DNA稀释液的制备提取耳组织样品的DNA，并稀释到需要的浓度，步骤如下(1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2 mL离心管中；(2)加入DNA裂解液800 μL，及蛋白酶K 30 μL（20 mg/mL）；(3)样品置于55℃恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；(4)加入Tris饱和酚800 μL，轻微混匀10 min，4℃ 12000 r/min离心12 min；(5)取650 μL上清液加Tris饱和酚氯仿异戊醇（25241）混合溶液800 μL，混摇10 min，4℃ 12000 r/min离心12 min；(6)取550 μL上清液，加氯仿800 μL，混摇10 min，4℃ 12000 r/min离心12min；（以下步骤换1.5 mL的离心管）(7)取450 μL上清液，加无水乙醇800 μL，3M乙酸钠40 μL，混摇6 min，4℃ 10000 r/min离心8 min；(8)弃上清液留下DNA沉淀团，加入1000 μL 70%乙醇，混摇5 min，4℃ 10000 r/min离心5 min，弃上清液（如需要可重复一次）；(9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；(10)样品加100 μL超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度统一稀释到30 ng/μL，置于-20℃下保存备用。1.2.2 目标位点引物的设计利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Primer-BLAST模块对rs81447100位点进行引物设计，目的片段为450 bp，上游引物序列为 GCCACTGGTATGGCCCTAAA下游引物序列为CCTTTGGGAGCTTGTGTTCC。引物由苏州金唯智公司合成。1.2.3 目的片段PCR扩增条件的摸索根据所设计的引物给出的建议退火温度58℃，用已经制备好的DNA稀释液作为模板进行PCR扩增反应取DNA模板1.5 μL、上下游引物各0.4 μL、PCR Mix试剂10.4 μL、双蒸水7.3 μL；设置PCR扩增体系预变性94℃ 1 min 30 s；变性94℃ 30 s；退火温度分别设置为55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃共6个温度梯度，时间30 s；延伸72℃ 60 s；30个循环；然后延伸5 min；4℃保存。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，如图2，图中退火温度为61℃的条带最亮，所以此目的片段进行PCR扩增的最佳退火温度为61℃。 图2 rs81447100位点摸条件PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Figure 2 Explore the suitable conditions of PCR products of rs81447100 by the way of agarose gel electrophoresis 1.2.4 目的片段PCR扩增在试验出的最佳退火温度61℃下，用已经制备好的DNA稀释液作为模板进行PCR扩增反应取DNA模板1.5 μL、上游引物和下游引物、各0.4 μL、PCR Mix试剂10.4 μL、双蒸水7.3 μL；设置PCR扩增体系预变性94℃ 1 min 30 s；变性94℃ 30 s；退火温度设置为61℃，时间30 s；延伸72℃ 60 s；30个循环；然后延伸5 min；4℃保存。1.2.5 利用凝胶电泳技术对扩增结果进行检测PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，若条带明亮说明扩增反应很成功；若条带单一，说明引物特异性好；若条带不明显或者没有，说明扩增反应不成功，需要重新进行扩增反应。如图3所示，本次PCR扩增反应很成功，可以进行下一步测序反应。图3 rs81447100位点PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Figure 3 PCR products of rs81447100 by the way of agarose gel electrophoresis 1.2.6 对目的片段进行DNA测序 将成功扩增的PCR剩余产物，送去苏州金唯智测序公司进行DNA测序。1.2.7 DNA测序结果与总产仔数关联分析利用SAS软件进行基因型对表型的影响效应分析。分析模型为Y=u+F-Y-S+G+A+P+E+e 其中Y是产仔数，u是群体均值,F-Y-S为厂年季固定效应，G为基因型的固定效应，A为加性效应，P为胎次的固定效应，E为母猪的永久环境效应，e为残差。1.2.8 目的标记附近基因查找在Ensembl(http://www.ensembl.org/)或NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中查找rs81447100位点附近的基因，查找范围为该为点上下各500kb，共1Mb范围内。2 结果与分析2.1 测序结果 由图4可知，rs81447100 位点3种基因型的测序图，依次为TT、TC和CC基因型。箭头所示处为rs81447100 SNP位点 。图4 rs81447100位点三种基因型的测序图Figure 4 The sequencing figure of three genotypes of rs814471002.2 结果分析2.2.1 DNA测序结果与总产仔数关联分析将测序公司发回的测序结果用DNAman软件与GenBank中猪的相关基因片段序列进行比对、分析，判读突变的基因型，如图4所示。表2给出了rs81447100T/C突变位点在纯种二花脸群体中对窝总产仔数的影响效应。由表2可知，纯种二花脸猪中，rs81447100T/C位点的TT基因型个体与CC型个体相比较结果不显著。表3给出了rs81447100T/C突变位点在含二花脸血统的苏太猪群体中对窝总产仔数的影响效应。由表3可知，含二花脸血统的苏太猪中，rs81447100T/C位点的CC基因型个体与TT型个体相比较窝总产仔数平均增加0.89头。由此可见，在苏太猪种中，继代选育rs81447100T/C位点的CC型个体，可逐步提高苏太母猪的窝总产仔数，从而达到提高苏太母猪繁殖性能的目的。2.2.2目的标记附近基因查找结果如图5所示，在该位点上下游1Mb区域查找基因MRPS22, COPB2, RBP2, RBP1, CLSTN2, TRIM42, SLC25A36，其中RBP1，RBP2属于RBP家族，已被报道与猪繁殖性能相关。图5 Ensembl数据库中查找rs81447100 位点附近的基因结果Figure 5 The result of gene near the rs81447100 T/C loci which find from Ensembl 3 讨论3.1 扩大群体进一步验证该位点的可靠性本研究通过对全基因组扫描找到的rs81447100 SNP位点与具有准确繁殖记录的181头纯种二花脸母猪和173头含二花脸血统的苏太猪产仔数的关联性分析，结果发现二者存在显著的相关性，在本试验所用的181头纯种二花脸猪群体中，rs81447100 T/C位点的TT基因型与CC基因型个体相比较总产仔数差异不显著；在173头含二花脸血统的苏太猪群体中，发现二者存在显著的相关性，rs81447100 T/C位点的CC基因型个体与TT型个体相比较窝总产仔数平均增加0.89头。rs81447100 SNP位点基因型与猪窝产仔数的关联性分析结果在纯种二花脸猪群体和苏太猪群体中表现不一致。究其原因，可能是因为本次研究所选取的二花脸群体较小，且二花脸猪来自于两个猪场，遗传背景不甚相同。而在含二花脸血统的苏太猪群体中该位点的CC型为经产产活仔数优势基因型，这说明rs81447100仍然极有可能是影响二花脸猪产仔数性状的主效SNP位点。所以后续需要继续扩大二花脸猪的验证群体，并在其他含二花脸血统的地方猪种和西方猪种中进一步验证该位点的可靠性。3.2 进一步筛选影响高产仔性状主效基因母猪产仔数性状是复杂的低遗传力繁殖性状，为了进一步研究影响产仔数性状的相关因素，基于rs81447100位点的基础上，在Ensembl数据库中其附近的基因，结果在这个SNP位点附近找到了一些基因MRPS22, COPB2, RBP2, RBP1, CLSTN2, TRIM42, SLC25A36, 其中RBP1，RBP2属于RBP家族，已被报道与猪繁殖性能相关。视黄醇结合蛋白（RBPs）是体内的一种低分子量载脂蛋白，其六种结构形式分别为RBP1、RBP2、RBP3和RBP4、RBP5、RBP7[7]。Messer等[8]在梅山猪×大白猪以及欧洲野猪×大白猪的6个三世代参考家系中发现，RARG和RBP4基因分别可以控制0.21头/窝、0.52头/窝的产仔数; 同时也分析了27头对照组母猪的242窝产仔记录，结果表明，RARG和RBP4基因可分别控制0.14头/窝、0.45头/窝的产仔数。Rothschild等[9]对梅山猪、大白猪等6个商品系的2555个产仔记录的分析表明，RBP4基因对于产仔数和活仔数的加性效应分别为0.23头/窝，0.15头/窝。3.3 加强对二花脸猪与含有其血统猪种的对照研究苏太猪是1999年通过国家畜禽品种审定委员会和农业部的新品种审定的中国瘦肉型猪新猪种，它是以太湖流域地方猪种为基础母本,导人外种杜洛克公猪血统培育而来，它保持了太湖流域地方猪种的高繁殖性能及肉质鲜美、适应性强等优点；同时表现出瘦肉率高、生长速度快等国外优良猪种的性能,具有明显的杂交优势和推广价值，是生产瘦肉型商品猪的理想母本[10]。对二花脸高产仔数优良性状的研究有利于提高含有其血统的商品猪种的性状，转变为经济价值。3.4 影响猪产仔数性状的其它因素猪产仔数性状是一个复杂的受多基因控制的数量性状，这个性状受很多因素的影响，遗传因素的遗传力仅有0.1-0.15左右[11]，除了受到遗传因素影响，产仔数还受到饲料、疫病以及环境等因素的影响[12,13]。此外，猪的生产效率决定于有效活仔数，不仅提高母猪的产仔数，而且能更好的提高仔猪的成活率，才能真正快速有效地提高养猪生产和经济效益[14,15]。因此，选育更高繁殖性能的群体或品种，不仅要加大遗传因素的研究，也要重视其他方面的因素的研究。4 总结本研究针对全基因组扫描发现的rs81447100位点进行了引物设计，并以提取的132头具有准确窝产总仔数记录的纯种二花脸母猪和苏太北桥场的213头苏太猪的DNA为模板，进行了PCR扩增反应，对扩增产物进行DNA测序，得到了测序结果。测序结果用DNAman软件与GenBank中猪的相关基因片段序列进行比对、分析，判读突变的基因型，并利用SAS软件进行基因型对表型的影响效应分析，证明了含二花脸血统的苏太猪13号染色体rs81447100位点与总产仔数成显著相关，为苏太猪高繁殖力基因的鉴别提供一些理论参考。致谢参考文献[1] 郭晓令, 姜志华, 李齐贤，等. 太湖猪繁殖高产的遗传基础初探 [J]. 上海畜牧兽医通讯,1992, 01:2-3.[2] 国家畜禽遗传资源委员会组. 中国畜禽遗传资源志·猪志 [M]． 北京: 中国农业出社， 2011:43.[3] 储明星,吴常信,张建生,等. 猪窝产仔数的遗传分析 [J]. 遗传学报, 2001, 28(4):317-321.[4] Buske B, Sternstein I, Brockmann G. QTL and candidate genes for fecundity in sows [J]. Animal Reproduction Science, 2006, 95(3-4):167-183.[5] 王怀禹. 视黄醇结合蛋白4（RBP4）基因多态性对猪繁殖性能的影响 [J]. 养猪，2015，4:73-76．[6] 吴井生. 猪繁殖性状相关基因遗传效应及表达规律的研究 [D]. 扬州扬州大学，2013.[7]蒲蕾.RBP4干扰调控猪脂肪细胞 PI3K/Akt 信号 [D].陕西:西北农林科技大学,2013.[8] Messer L, Wang L, Legant C. Mapping and investigation of candidate genes for litter size in French Large White Pigs [J]. Animal Genetics, 1996 , 27:114.[9] Rothschild M F, Messer L, Day A. Investigation of the retionl-binding Protein 4(RBP4) gene as a candidate gene for increased litter size in pigs [J]. Mamm Genome, 2000, 11:75-77[10] 佚名. 瘦肉型猪新品种苏太猪 [J]. 当代畜禽养殖业,2001,9:38.[11] RK J, MK N, DS C. Responses in ovulation rate, embryonal survival, and litter traits in swine to 14 generations of selection to increase litter size [J]. Journal of Animal Science, 1999, 77(3):541-557.[12] 叶榕坤. 母猪胚胎死亡流产的原因及预防措施 [J]. 中国畜禽种业, 2012, 8(10):48-49.[13] 邵倩, 白涛涛, 胡永浩. 规模化养猪场母猪流产的原因及防治措施[J]. 湖北畜牧兽医, 2014, (6):22-23. [14] 林国珊. 二花脸猪特异选择位点与猪产仔数的关联性分析 [D]. 江西农业大学, 2013.[15] 罗成文. 科学运用仔猪培育新技术是提高仔猪成活率的关键 [J]. 北京农业, 2014, (36).附录表2 rs81447100 SNP位点与二花脸母猪窝总产仔数的关联分析Table2 The association between the rs81447100 T/C loci and the litter size record of Erhualian pigsSNP染色体位置基因型个体数初产经产总产仔数（TNB）P 值产活仔数(NBA)P 值总产仔数P 值产活仔数P 值均值±标准误均值±标准误均值±标准误均值±标准误rs814471001388.65MbTT10911.33±0.5710.48±0.6315.29±1.0814.46±1.05TC5611.94±0.550.50711.20±0.610.33714.94±1.070.70714.35±1.040.780CC1611.70±0.8711.36±0.9615.00±1.2014.05±1.16注P值由F检验计算得出。表3 rs81447100 SNP位点与苏太母猪窝总产仔数的关联分析Table2 The association between the rs81447100 T/C loci and the litter size record of Sutai pigsSNP染色体位置基因型个体数初产经产总产仔数（TNB）P 值产活仔数(NBA)P 值总产仔数P 值产活仔数P 值均值±标准误均值±标准误均值±标准误均值±标准误rs814471001388.65MbTT7910.20±0.489.66±0.5111.27±0.2410.30±0.23abTC7010.26±0.500.1319.59±0.500.23411.24±0.260.32210.06±0.25b0.036CC2411.70±0.7610.89±0.7811.89±0.3911.19±0.37a注P值由F检验计算得出；a、b表示差异显著（P < 0.05）
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1材料与方法2
1.1试验材料2
1.2试验方法3
1.2.1样品DNA稀释液制备3
1.2.2目标位点引物的设计3
1.2.3目的片段PCR扩增条件的摸索3
1.2.4目的片段PCR扩增4
1.2.5利用凝胶电泳技术对扩增结果进行检测4
1.2.6对目的片段进行DNA测序4
2结果与分析4
2.1测序结果4
2.2结果分析5
2.2.1 DNA测序结果与总产仔数关联分析 5
2.2.2查找目的标记附近基因5
3讨论5
3.1 扩大群体进一步验证该位点的可靠性5
3.2 进一步筛选影响高产仔性状主效基因5
3.3 加强对二花脸猪与含有其血统猪种的对照研究6
3.4 影响猪产仔数性状的其它因素6
4总结 6
致谢 6
参考文献7
附录8
图1 2
图2 3
图3 4
图4 4
图5 5
表1 2
表2 8
表3 8
猪13号染色体基因位点rs81447100与二花脸猪、苏太猪产仔数关联性分析
引言
analyzed the DNA sequencing of rs81447100, the specific locus on the DNA from 181 Erhualian pigs and 173 Sutai pigs which contain Erhualians’ descent, and then analyzed the association between the genotypes and the litter size record. The result showed thatThere was no significant difference of litter size among the 181 Erhualian pigs with TT genotype of rs81447100T/C loci, TC genotype and CC genotype. In the 173 Sutai pigs, litter size from 2 to 7 parity of CC genotype of rs81447100 T/C loci significantly higher than that of TT genotype (P < 0.05). The multiparity litter size of CC genotype increased by an average of 0.89. So as a result, rs81447100 T/C loci can be the mark of further breeding for Sutai pig .Key words: Erhualian pig; Sutai pig; loci rs81447100; litter size; association产仔数是猪最为重要的经济性状，如果能提高猪的产仔性能，将直接影响猪的生产效率，给现代养猪业带来可观的经济效益。二花脸猪是国家级畜禽遗传资源保护品种，以性成熟早、繁殖力高、产仔多、母性好等优良特性而闻名于世[1]；曾创造窝总产仔数42头的世界最高单胎产仔纪录[2]，是优秀的遗传资源；研究其高繁殖特性以提高其商品猪的产仔性能，对我国养猪业的发展具有重要意义。母猪繁殖力的高低, 主要取决于母猪本身的遗传基础[1]。产仔数受复杂多基因控制，遗传力很低，采用传统的选育技术提高猪产仔数进展较慢[3]，近些年通过分子育种新技术提高猪的繁殖性能倍受重视，其中候选基因法与定位数量性状基因位点（QTL）法是研究者关注的重点，尽管产仔数相关候选基因或QTL报道较多，但二花脸猪高产的遗传机理尚不清楚。在候选基因方面，鉴别的影响产仔数的候选基因较多[4]，包括报道较多的ESR、FSHβ、RARG、RBP4、PRLR和OPN等基因，但这些基因位点通常只在特定的群体存在关联性[5,6]。在QTL定位方面，从国际猪QTL数据库可知，目前已成功定位了616个与产仔数相关的QTL，其中报道的与二花脸或太湖流域地方猪种产仔数相关的QTL主要定位于1、5、6、7、8、12、13和15号染色体。表1 二花脸产仔数极端高、低产组间产仔数差异性分析结果Table1. Difference analysis of Erhualian pigs between high and low level组别个体数育种值总产仔数产活仔数Top 12%250.87016.54±0.28A15.66±0.24ABottom 12%25-1.17212.90±0.27B12.37±0.26B注 A，B表示差异达极显著水平，即P < 0.01图1 二花脸高、低产群体经产产活仔数GWAS分析结果Figure 1 GWAS analysis of number born alive (NBA) of multiparity Erhualian pigs between high and low level1 材料与方法1.1试验材料本研究的实验材料猪耳组织样品采集于两个不同猪场。其中109头纯种二花脸母猪来自于江苏常熟二花脸国家保种场，另72头纯种二花脸母猪和173头含二花脸血统的苏太母猪来自于江苏苏太企业有限公司猪场，并从两场获得这些母猪的繁殖记录。 样品采集后被装入含75%酒精的离心管，置于-20℃冰箱内保存备用。1.2 试验方法1.2.1 样品DNA稀释液的制备提取耳组织样品的DNA，并稀释到需要的浓度，步骤如下(1)取黄豆大小组织样，尽量剪碎放入2 mL离心管中；(2)加入DNA裂解液800 μL，及蛋白酶K 30 μL（20 mg/mL）；(3)样品置于55℃恒温箱中孵育过夜，至管中无组织块为止；(4)加入Tris饱和酚800 μL，轻微混匀10 min，4℃ 12000 r/min离心12 min；(5)取650 μL上清液加Tris饱和酚氯仿异戊醇（25241）混合溶液800 μL，混摇10 min，4℃ 12000 r/min离心12 min；(6)取550 μL上清液，加氯仿800 μL，混摇10 min，4℃ 12000 r/min离心12min；（以下步骤换1.5 mL的离心管）(7)取450 μL上清液，加无水乙醇800 μL，3M乙酸钠40 μL，混摇6 min，4℃ 10000 r/min离心8 min；(8)弃上清液留下DNA沉淀团，加入1000 μL 70%乙醇，混摇5 min，4℃ 10000 r/min离心5 min，弃上清液（如需要可重复一次）；(9)将离心管放入通风橱，吹干至管内无小滴；(10)样品加100 μL超纯水，轻微吹打至DNA溶解，经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后将浓度统一稀释到30 ng/μL，置于-20℃下保存备用。1.2.2 目标位点引物的设计利用NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）中的Primer-BLAST模块对rs81447100位点进行引物设计，目的片段为450 bp，上游引物序列为 GCCACTGGTATGGCCCTAAA下游引物序列为CCTTTGGGAGCTTGTGTTCC。引物由苏州金唯智公司合成。1.2.3 目的片段PCR扩增条件的摸索根据所设计的引物给出的建议退火温度58℃，用已经制备好的DNA稀释液作为模板进行PCR扩增反应取DNA模板1.5 μL、上下游引物各0.4 μL、PCR Mix试剂10.4 μL、双蒸水7.3 μL；设置PCR扩增体系预变性94℃ 1 min 30 s；变性94℃ 30 s；退火温度分别设置为55℃、57℃、59℃、61℃、63℃、65℃共6个温度梯度，时间30 s；延伸72℃ 60 s；30个循环；然后延伸5 min；4℃保存。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，如图2，图中退火温度为61℃的条带最亮，所以此目的片段进行PCR扩增的最佳退火温度为61℃。 图2 rs81447100位点摸条件PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Figure 2 Explore the suitable conditions of PCR products of rs81447100 by the way of agarose gel electrophoresis 1.2.4 目的片段PCR扩增在试验出的最佳退火温度61℃下，用已经制备好的DNA稀释液作为模板进行PCR扩增反应取DNA模板1.5 μL、上游引物和下游引物、各0.4 μL、PCR Mix试剂10.4 μL、双蒸水7.3 μL；设置PCR扩增体系预变性94℃ 1 min 30 s；变性94℃ 30 s；退火温度设置为61℃，时间30 s；延伸72℃ 60 s；30个循环；然后延伸5 min；4℃保存。1.2.5 利用凝胶电泳技术对扩增结果进行检测PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶中电泳检测，若条带明亮说明扩增反应很成功；若条带单一，说明引物特异性好；若条带不明显或者没有，说明扩增反应不成功，需要重新进行扩增反应。如图3所示，本次PCR扩增反应很成功，可以进行下一步测序反应。图3 rs81447100位点PCR产物琼脂糖凝胶电泳图Figure 3 PCR products of rs81447100 by the way of agarose gel electrophoresis 1.2.6 对目的片段进行DNA测序 将成功扩增的PCR剩余产物，送去苏州金唯智测序公司进行DNA测序。1.2.7 DNA测序结果与总产仔数关联分析利用SAS软件进行基因型对表型的影响效应分析。分析模型为Y=u+F-Y-S+G+A+P+E+e 其中Y是产仔数，u是群体均值,F-Y-S为厂年季固定效应，G为基因型的固定效应，A为加性效应，P为胎次的固定效应，E为母猪的永久环境效应，e为残差。1.2.8 目的标记附近基因查找在Ensembl(http://www.ensembl.org/)或NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)数据库中查找rs81447100位点附近的基因，查找范围为该为点上下各500kb，共1Mb范围内。2 结果与分析2.1 测序结果 由图4可知，rs81447100 位点3种基因型的测序图，依次为TT、TC和CC基因型。箭头所示处为rs81447100 SNP位点 。图4 rs81447100位点三种基因型的测序图Figure 4 The sequencing figure of three genotypes of rs814471002.2 结果分析2.2.1 DNA测序结果与总产仔数关联分析将测序公司发回的测序结果用DNAman软件与GenBank中猪的相关基因片段序列进行比对、分析，判读突变的基因型，如图4所示。表2给出了rs81447100T/C突变位点在纯种二花脸群体中对窝总产仔数的影响效应。由表2可知，纯种二花脸猪中，rs81447100T/C位点的TT基因型个体与CC型个体相比较结果不显著。表3给出了rs81447100T/C突变位点在含二花脸血统的苏太猪群体中对窝总产仔数的影响效应。由表3可知，含二花脸血统的苏太猪中，rs81447100T/C位点的CC基因型个体与TT型个体相比较窝总产仔数平均增加0.89头。由此可见，在苏太猪种中，继代选育rs81447100T/C位点的CC型个体，可逐步提高苏太母猪的窝总产仔数，从而达到提高苏太母猪繁殖性能的目的。2.2.2目的标记附近基因查找结果如图5所示，在该位点上下游1Mb区域查找基因MRPS22, COPB2, RBP2, RBP1, CLSTN2, TRIM42, SLC25A36，其中RBP1，RBP2属于RBP家族，已被报道与猪繁殖性能相关。图5 Ensembl数据库中查找rs81447100 位点附近的基因结果Figure 5 The result of gene near the rs81447100 T/C loci which find from Ensembl 3 讨论3.1 扩大群体进一步验证该位点的可靠性本研究通过对全基因组扫描找到的rs81447100 SNP位点与具有准确繁殖记录的181头纯种二花脸母猪和173头含二花脸血统的苏太猪产仔数的关联性分析，结果发现二者存在显著的相关性，在本试验所用的181头纯种二花脸猪群体中，rs81447100 T/C位点的TT基因型与CC基因型个体相比较总产仔数差异不显著；在173头含二花脸血统的苏太猪群体中，发现二者存在显著的相关性，rs81447100 T/C位点的CC基因型个体与TT型个体相比较窝总产仔数平均增加0.89头。rs81447100 SNP位点基因型与猪窝产仔数的关联性分析结果在纯种二花脸猪群体和苏太猪群体中表现不一致。究其原因，可能是因为本次研究所选取的二花脸群体较小，且二花脸猪来自于两个猪场，遗传背景不甚相同。而在含二花脸血统的苏太猪群体中该位点的CC型为经产产活仔数优势基因型，这说明rs81447100仍然极有可能是影响二花脸猪产仔数性状的主效SNP位点。所以后续需要继续扩大二花脸猪的验证群体，并在其他含二花脸血统的地方猪种和西方猪种中进一步验证该位点的可靠性。3.2 进一步筛选影响高产仔性状主效基因母猪产仔数性状是复杂的低遗传力繁殖性状，为了进一步研究影响产仔数性状的相关因素，基于rs81447100位点的基础上，在Ensembl数据库中其附近的基因，结果在这个SNP位点附近找到了一些基因MRPS22, COPB2, RBP2, RBP1, CLSTN2, TRIM42, SLC25A36, 其中RBP1，RBP2属于RBP家族，已被报道与猪繁殖性能相关。视黄醇结合蛋白（RBPs）是体内的一种低分子量载脂蛋白，其六种结构形式分别为RBP1、RBP2、RBP3和RBP4、RBP5、RBP7[7]。Messer等[8]在梅山猪×大白猪以及欧洲野猪×大白猪的6个三世代参考家系中发现，RARG和RBP4基因分别可以控制0.21头/窝、0.52头/窝的产仔数; 同时也分析了27头对照组母猪的242窝产仔记录，结果表明，RARG和RBP4基因可分别控制0.14头/窝、0.45头/窝的产仔数。Rothschild等[9]对梅山猪、大白猪等6个商品系的2555个产仔记录的分析表明，RBP4基因对于产仔数和活仔数的加性效应分别为0.23头/窝，0.15头/窝。3.3 加强对二花脸猪与含有其血统猪种的对照研究苏太猪是1999年通过国家畜禽品种审定委员会和农业部的新品种审定的中国瘦肉型猪新猪种，它是以太湖流域地方猪种为基础母本,导人外种杜洛克公猪血统培育而来，它保持了太湖流域地方猪种的高繁殖性能及肉质鲜美、适应性强等优点；同时表现出瘦肉率高、生长速度快等国外优良猪种的性能,具有明显的杂交优势和推广价值，是生产瘦肉型商品猪的理想母本[10]。对二花脸高产仔数优良性状的研究有利于提高含有其血统的商品猪种的性状，转变为经济价值。3.4 影响猪产仔数性状的其它因素猪产仔数性状是一个复杂的受多基因控制的数量性状，这个性状受很多因素的影响，遗传因素的遗传力仅有0.1-0.15左右[11]，除了受到遗传因素影响，产仔数还受到饲料、疫病以及环境等因素的影响[12,13]。此外，猪的生产效率决定于有效活仔数，不仅提高母猪的产仔数，而且能更好的提高仔猪的成活率，才能真正快速有效地提高养猪生产和经济效益[14,15]。因此，选育更高繁殖性能的群体或品种，不仅要加大遗传因素的研究，也要重视其他方面的因素的研究。4 总结本研究针对全基因组扫描发现的rs81447100位点进行了引物设计，并以提取的132头具有准确窝产总仔数记录的纯种二花脸母猪和苏太北桥场的213头苏太猪的DNA为模板，进行了PCR扩增反应，对扩增产物进行DNA测序，得到了测序结果。测序结果用DNAman软件与GenBank中猪的相关基因片段序列进行比对、分析，判读突变的基因型，并利用SAS软件进行基因型对表型的影响效应分析，证明了含二花脸血统的苏太猪13号染色体rs81447100位点与总产仔数成显著相关，为苏太猪高繁殖力基因的鉴别提供一些理论参考。致谢参考文献[1] 郭晓令, 姜志华, 李齐贤，等. 太湖猪繁殖高产的遗传基础初探 [J]. 上海畜牧兽医通讯,1992, 01:2-3.[2] 国家畜禽遗传资源委员会组. 中国畜禽遗传资源志·猪志 [M]． 北京: 中国农业出社， 2011:43.[3] 储明星,吴常信,张建生,等. 猪窝产仔数的遗传分析 [J]. 遗传学报, 2001, 28(4):317-321.[4] Buske B, Sternstein I, Brockmann G. QTL and candidate genes for fecundity in sows [J]. Animal Reproduction Science, 2006, 95(3-4):167-183.[5] 王怀禹. 视黄醇结合蛋白4（RBP4）基因多态性对猪繁殖性能的影响 [J]. 养猪，2015，4:73-76．[6] 吴井生. 猪繁殖性状相关基因遗传效应及表达规律的研究 [D]. 扬州扬州大学，2013.[7]蒲蕾.RBP4干扰调控猪脂肪细胞 PI3K/Akt 信号 [D].陕西:西北农林科技大学,2013.[8] Messer L, Wang L, Legant C. Mapping and investigation of candidate genes for litter size in French Large White Pigs [J]. Animal Genetics, 1996 , 27:114.[9] Rothschild M F, Messer L, Day A. Investigation of the retionl-binding Protein 4(RBP4) gene as a candidate gene for increased litter size in pigs [J]. Mamm Genome, 2000, 11:75-77[10] 佚名. 瘦肉型猪新品种苏太猪 [J]. 当代畜禽养殖业,2001,9:38.[11] RK J, MK N, DS C. Responses in ovulation rate, embryonal survival, and litter traits in swine to 14 generations of selection to increase litter size [J]. Journal of Animal Science, 1999, 77(3):541-557.[12] 叶榕坤. 母猪胚胎死亡流产的原因及预防措施 [J]. 中国畜禽种业, 2012, 8(10):48-49.[13] 邵倩, 白涛涛, 胡永浩. 规模化养猪场母猪流产的原因及防治措施[J]. 湖北畜牧兽医, 2014, (6):22-23. [14] 林国珊. 二花脸猪特异选择位点与猪产仔数的关联性分析 [D]. 江西农业大学, 2013.[15] 罗成文. 科学运用仔猪培育新技术是提高仔猪成活率的关键 [J]. 北京农业, 2014, (36).附录表2 rs81447100 SNP位点与二花脸母猪窝总产仔数的关联分析Table2 The association between the rs81447100 T/C loci and the litter size record of Erhualian pigsSNP染色体位置基因型个体数初产经产总产仔数（TNB）P 值产活仔数(NBA)P 值总产仔数P 值产活仔数P 值均值±标准误均值±标准误均值±标准误均值±标准误rs814471001388.65MbTT10911.33±0.5710.48±0.6315.29±1.0814.46±1.05TC5611.94±0.550.50711.20±0.610.33714.94±1.070.70714.35±1.040.780CC1611.70±0.8711.36±0.9615.00±1.2014.05±1.16注P值由F检验计算得出。表3 rs81447100 SNP位点与苏太母猪窝总产仔数的关联分析Table2 The association between the rs81447100 T/C loci and the litter size record of Sutai pigsSNP染色体位置基因型个体数初产经产总产仔数（TNB）P 值产活仔数(NBA)P 值总产仔数P 值产活仔数P 值均值±标准误均值±标准误均值±标准误均值±标准误rs814471001388.65MbTT7910.20±0.489.66±0.5111.27±0.2410.30±0.23abTC7010.26±0.500.1319.59±0.500.23411.24±0.260.32210.06±0.25b0.036CC2411.70±0.7610.89±0.7811.89±0.3911.19±0.37a注P值由F检验计算得出；a、b表示差异显著（P < 0.05）
目录
摘要1
关键词1
Abstract 1
Key words 1
引言1
1材料与方法2
1.1试验材料2
1.2试验方法3
1.2.1样品DNA稀释液制备3
1.2.2目标位点引物的设计3
1.2.3目的片段PCR扩增条件的摸索3
1.2.4目的片段PCR扩增4
1.2.5利用凝胶电泳技术对扩增结果进行检测4
1.2.6对目的片段进行DNA测序4
2结果与分析4
2.1测序结果4
2.2结果分析5
2.2.1 DNA测序结果与总产仔数关联分析 5
2.2.2查找目的标记附近基因5
3讨论5
3.1 扩大群体进一步验证该位点的可靠性5
3.2 进一步筛选影响高产仔性状主效基因5
3.3 加强对二花脸猪与含有其血统猪种的对照研究6
3.4 影响猪产仔数性状的其它因素6
4总结 6
致谢 6
参考文献7
附录8
图1 2
图2 3
图3 4
图4 4
图5 5
表1 2
表2 8
表3 8
猪13号染色体基因位点rs81447100与二花脸猪、苏太猪产仔数关联性分析
引言
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