粘细菌的分离纯化和鉴定
目录
1 引言 1
1.1 粘细菌的研究背景 1
1.2 粘细菌的生物学特性 2
1.3 粘细菌的生态分布 3
1.4 粘细菌的代谢产物 4
1.5 粘细菌的发展前景展望及课题研究意义 5
2 材料与方法 6
2.1 实验材料与设备 6
2.2 实验方法 9
3 结果 15
3.1 粘细菌的分离筛选情况 15
3.2 粘细菌的生长曲线 15
3.3 粘细菌的生物学形态 16
3.4 粘细菌的生理生化实验 17
3.5 粘细菌的生长温度实验 18
3.6 粘细菌的生长酸碱度实验 18
3.7 粘细菌的药物敏感实验 19
3.8 全DNA的G+C%含量相关数据的测定 21
4 讨论 23
4.1 粘细菌的分离 23
4.2 粘细菌的纯化 24
4.3 关于两种粘细菌全DNA的G+C%含量测定的讨论 24
结论 25
致谢 26
参考文献 27
1 引言
1.1 粘细菌的研究背景
粘细菌（Myxobacteira）是一类具有复杂多细胞行为的原核生物，在细胞的生长、摄食、运动和分化发育等方面表现出显著的社会性特征。粘细菌是一类特殊的革兰氏阴性杆菌，能够进行滑行运动，具有复杂的多细胞行为和形态发生过程，是一类“生活在真核生物边缘”的高等的原核生物类群，能够产生众多结构新颖、作用机制独特的生物活性物质[1]是其另一重要特征，已经成为生物活性次级代谢产物的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
“微工厂”，成为国内外研究者们关注的焦点。
根据《Bergey’s manual of systematic bacteriology》第八版，目前粘细菌已确定的分类主要包括8个属约31个种，12个属分别为：粘球菌属（Myxococcus），原囊菌属（Archangium），孢囊杆菌属（Cystobacter），蜂窝囊菌属（Melittangium），标桩菌属（Stigmatella），多囊菌属（Polyangium），小囊菌属（Nannocystis），和软骨霉状菌（Chondromyces）属。根据营养的差异可细胞可滑行到菌落外，完全脱离菌落而形成单独的菌落。
将粘细菌划分为两个生理亚群：溶细菌群（Bacteriolytic group）和溶纤维素群（Cellulolytic group）。大多数粘细菌不能利用蔗糖和淀粉，它们能产生胞外酶水解大分子物质，如蛋白质、核酸、脂肪酸酯以及包括纤维素在内的多种碳水化合物，多数粘细菌能在含蛋白胨或酪蛋白水解物的固体培养基上生长，利用氨基酸或小分子肽类为能源、碳源和氮源，因此，酵母提取物是液体培养粘细菌时最重要的底物。溶纤维素群中堆囊菌属能分解纤维素，而大多数粘细菌属于前者，它们能溶解其它原核或真核微生物，以死的或活的细菌、真菌和藻类或现成的有机物作为营养来源。
粘细菌为严格好氧的化能有机营养型微生物，它们无光合色素。营养细胞杆状柔软，细胞长度一般为3μm～6μm，直径约为0.7μm～1.0μm，其基因组在原核生物中是最大的，约为9454kb～10010kb，比较接近真核生物的基因组，营养细胞没有普通细菌那样坚硬的细胞壁，菌体是柔韧可屈挠的细胞；折光率低，没有鞭毛，在固体表面能缓慢滑动[2]；在菌落中，这种滑行的细胞成群地从菌落边缘向菌落外滑动，其后留下一条条黏液痕迹，同时菌落向外扩张，有时这种滑动细胞可滑行到菌落外，完全脱离菌落而形成单独的菌落。
粘细菌的生长周期可分为两个阶段，即营养细胞阶段和休眠细胞阶段。粘细菌的营养细胞可分为细胞Ⅰ型和细胞Ⅱ型两种类型，细胞Ⅰ型为两端削尖，细长的杆状；细胞Ⅱ型为两端钝圆，粗短的柱形。细胞Ⅰ型的黏孢子，最后形成杆状或球形；细胞Ⅱ型的黏孢子与其营养细胞形态相似。营养细胞通过横断分裂增殖，营养细胞发育到一定阶段，则向一定位置聚集成各种形状的堆团，形成无柄的或有柄的子实体。子实体形态随粘细菌种类的不同而异，有的仅为简单的堆团或黏液，有的在传代过程中消失，形态不稳定，有的则形成具有特征性状和孢子囊的复杂结构。子实体中含有孢囊的，其中包含休眠细胞；休眠细胞也可以不在孢囊中，直接包埋在于实体的黏液中。球囊粘细菌科的休眠细胞为球形或椭圆形，有折光性强染色深的外壁，称之为小孢囊，休眠细胞转化成营养细胞后从孢囊脱出。
与其它细菌相比，粘细菌有几大突出特征：（1）可以形成子实体，在营养饥饿的条件下，菌落内的细胞开始聚集堆积成多细胞的子实体，子实体的形状和颜色随菌种而异，但经常是红、黄等鲜艳的颜色；（2）菌体能向体外分泌多糖黏液，将细胞团包埋于黏液中，并借助于黏液进行滑行运动；（3）产生丰富的生物活性物质，这些物质不但结构新颖，而且作用机制多样，这为寻找新药先导化合物提供了较好的菌种资源；（4）细胞DNA中含有较高的G+C%（67%～71%）。
1.2 粘细菌的生物学特性
粘细菌是严格的好氧微生物，最适生长温度在30℃左右，广泛分布在中性或微碱性的土壤中，也可以在朽木、树皮、地衣和草食动物的粪便等腐物上[3]生长。粘细菌的基因组在原核生物中是最大的，约为9，454～10，010kb，介于原核微生物和真核微生物之间，因此尽管粘细菌在系统分类上属于细菌，但某些生物学特性却表现出与真核生物更多的相似形。当粘细菌处于饥饿干旱等不利环境时，就启动多细胞结构的分化过程，在固体表面上逐步发育为肉眼可见、颜色鲜艳的子实体，同时在其内部形成粘孢子（Myxospore）。粘细菌的子实体有鲜艳的颜色，通常肉眼可以识别。1809年，德国植物学家LinkH .F.发现并命名了第一株粘细菌，但将粘细菌的子实体误认为是真菌中的腹菌。1857年，英国生物学家M.J.Berkeley发现和命名了另两个种属的粘细菌——橙色标桩菌（Stigmatella aurantiaca）和藏红花软骨霉状菌（Chondromyces crocatus），但将它们归于真菌的丝孢菌类群中。1892年，美国植物学家Roland Thaxter第一个将这些具有子实体的特殊微生物归于粘细菌（Myxobacteria），并描述了它们的生活周期。粘细菌的粘孢子具有较强的抗性，它耐热，抗干燥、辐射和去污剂。在土壤中它可存活10年以上，是典型的休眠体，可作为分离和保存粘细菌的理想材料。粘细菌的分化程序分明，其生长发育过程一般分为两个阶段——营养细胞生长期和细胞发育期，在其分化发育研究中，黄色粘细菌（Myxococcus xanthus）是著名的多细胞行为、形态发生及社会行为学研究的模式菌株。
在查阅已有文献之后，发现粘细菌产生的生物活性物质[4]具有以下几个方面的特点：
RNA酶 生化试剂 北京Biodes生物科技有限公司
酪蛋白胨 生化试剂 北京双旋微生物培养基制品厂
氢氧化钠 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司
刚果红 生物染色剂 中国.上海试剂三厂
2.1.4 仪器
名称型号厂家
立式压力蒸汽灭菌锅YM上海三申医疗器械有限公司
1 引言 1
1.1 粘细菌的研究背景 1
1.2 粘细菌的生物学特性 2
1.3 粘细菌的生态分布 3
1.4 粘细菌的代谢产物 4
1.5 粘细菌的发展前景展望及课题研究意义 5
2 材料与方法 6
2.1 实验材料与设备 6
2.2 实验方法 9
3 结果 15
3.1 粘细菌的分离筛选情况 15
3.2 粘细菌的生长曲线 15
3.3 粘细菌的生物学形态 16
3.4 粘细菌的生理生化实验 17
3.5 粘细菌的生长温度实验 18
3.6 粘细菌的生长酸碱度实验 18
3.7 粘细菌的药物敏感实验 19
3.8 全DNA的G+C%含量相关数据的测定 21
4 讨论 23
4.1 粘细菌的分离 23
4.2 粘细菌的纯化 24
4.3 关于两种粘细菌全DNA的G+C%含量测定的讨论 24
结论 25
致谢 26
参考文献 27
1 引言
1.1 粘细菌的研究背景
粘细菌（Myxobacteira）是一类具有复杂多细胞行为的原核生物，在细胞的生长、摄食、运动和分化发育等方面表现出显著的社会性特征。粘细菌是一类特殊的革兰氏阴性杆菌，能够进行滑行运动，具有复杂的多细胞行为和形态发生过程，是一类“生活在真核生物边缘”的高等的原核生物类群，能够产生众多结构新颖、作用机制独特的生物活性物质[1]是其另一重要特征，已经成为生物活性次级代谢产物的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5^1^9^1^6^0^7^2^*
“微工厂”，成为国内外研究者们关注的焦点。
根据《Bergey’s manual of systematic bacteriology》第八版，目前粘细菌已确定的分类主要包括8个属约31个种，12个属分别为：粘球菌属（Myxococcus），原囊菌属（Archangium），孢囊杆菌属（Cystobacter），蜂窝囊菌属（Melittangium），标桩菌属（Stigmatella），多囊菌属（Polyangium），小囊菌属（Nannocystis），和软骨霉状菌（Chondromyces）属。根据营养的差异可细胞可滑行到菌落外，完全脱离菌落而形成单独的菌落。
将粘细菌划分为两个生理亚群：溶细菌群（Bacteriolytic group）和溶纤维素群（Cellulolytic group）。大多数粘细菌不能利用蔗糖和淀粉，它们能产生胞外酶水解大分子物质，如蛋白质、核酸、脂肪酸酯以及包括纤维素在内的多种碳水化合物，多数粘细菌能在含蛋白胨或酪蛋白水解物的固体培养基上生长，利用氨基酸或小分子肽类为能源、碳源和氮源，因此，酵母提取物是液体培养粘细菌时最重要的底物。溶纤维素群中堆囊菌属能分解纤维素，而大多数粘细菌属于前者，它们能溶解其它原核或真核微生物，以死的或活的细菌、真菌和藻类或现成的有机物作为营养来源。
粘细菌为严格好氧的化能有机营养型微生物，它们无光合色素。营养细胞杆状柔软，细胞长度一般为3μm～6μm，直径约为0.7μm～1.0μm，其基因组在原核生物中是最大的，约为9454kb～10010kb，比较接近真核生物的基因组，营养细胞没有普通细菌那样坚硬的细胞壁，菌体是柔韧可屈挠的细胞；折光率低，没有鞭毛，在固体表面能缓慢滑动[2]；在菌落中，这种滑行的细胞成群地从菌落边缘向菌落外滑动，其后留下一条条黏液痕迹，同时菌落向外扩张，有时这种滑动细胞可滑行到菌落外，完全脱离菌落而形成单独的菌落。
粘细菌的生长周期可分为两个阶段，即营养细胞阶段和休眠细胞阶段。粘细菌的营养细胞可分为细胞Ⅰ型和细胞Ⅱ型两种类型，细胞Ⅰ型为两端削尖，细长的杆状；细胞Ⅱ型为两端钝圆，粗短的柱形。细胞Ⅰ型的黏孢子，最后形成杆状或球形；细胞Ⅱ型的黏孢子与其营养细胞形态相似。营养细胞通过横断分裂增殖，营养细胞发育到一定阶段，则向一定位置聚集成各种形状的堆团，形成无柄的或有柄的子实体。子实体形态随粘细菌种类的不同而异，有的仅为简单的堆团或黏液，有的在传代过程中消失，形态不稳定，有的则形成具有特征性状和孢子囊的复杂结构。子实体中含有孢囊的，其中包含休眠细胞；休眠细胞也可以不在孢囊中，直接包埋在于实体的黏液中。球囊粘细菌科的休眠细胞为球形或椭圆形，有折光性强染色深的外壁，称之为小孢囊，休眠细胞转化成营养细胞后从孢囊脱出。
与其它细菌相比，粘细菌有几大突出特征：（1）可以形成子实体，在营养饥饿的条件下，菌落内的细胞开始聚集堆积成多细胞的子实体，子实体的形状和颜色随菌种而异，但经常是红、黄等鲜艳的颜色；（2）菌体能向体外分泌多糖黏液，将细胞团包埋于黏液中，并借助于黏液进行滑行运动；（3）产生丰富的生物活性物质，这些物质不但结构新颖，而且作用机制多样，这为寻找新药先导化合物提供了较好的菌种资源；（4）细胞DNA中含有较高的G+C%（67%～71%）。
1.2 粘细菌的生物学特性
粘细菌是严格的好氧微生物，最适生长温度在30℃左右，广泛分布在中性或微碱性的土壤中，也可以在朽木、树皮、地衣和草食动物的粪便等腐物上[3]生长。粘细菌的基因组在原核生物中是最大的，约为9，454～10，010kb，介于原核微生物和真核微生物之间，因此尽管粘细菌在系统分类上属于细菌，但某些生物学特性却表现出与真核生物更多的相似形。当粘细菌处于饥饿干旱等不利环境时，就启动多细胞结构的分化过程，在固体表面上逐步发育为肉眼可见、颜色鲜艳的子实体，同时在其内部形成粘孢子（Myxospore）。粘细菌的子实体有鲜艳的颜色，通常肉眼可以识别。1809年，德国植物学家LinkH .F.发现并命名了第一株粘细菌，但将粘细菌的子实体误认为是真菌中的腹菌。1857年，英国生物学家M.J.Berkeley发现和命名了另两个种属的粘细菌——橙色标桩菌（Stigmatella aurantiaca）和藏红花软骨霉状菌（Chondromyces crocatus），但将它们归于真菌的丝孢菌类群中。1892年，美国植物学家Roland Thaxter第一个将这些具有子实体的特殊微生物归于粘细菌（Myxobacteria），并描述了它们的生活周期。粘细菌的粘孢子具有较强的抗性，它耐热，抗干燥、辐射和去污剂。在土壤中它可存活10年以上，是典型的休眠体，可作为分离和保存粘细菌的理想材料。粘细菌的分化程序分明，其生长发育过程一般分为两个阶段——营养细胞生长期和细胞发育期，在其分化发育研究中，黄色粘细菌（Myxococcus xanthus）是著名的多细胞行为、形态发生及社会行为学研究的模式菌株。
在查阅已有文献之后，发现粘细菌产生的生物活性物质[4]具有以下几个方面的特点：
RNA酶 生化试剂 北京Biodes生物科技有限公司
酪蛋白胨 生化试剂 北京双旋微生物培养基制品厂
氢氧化钠 分析纯 上海久亿化学试剂有限公司
刚果红 生物染色剂 中国.上海试剂三厂
2.1.4 仪器
名称型号厂家
立式压力蒸汽灭菌锅YM上海三申医疗器械有限公司
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