河蚬蛋白酶解制备活性肽工艺研究
目 录
1 引言 1
1.1 河蚬简介 1
1.2 河蚬的生物价值与研究现状 1
1.3 活性肽简介 2
1.4抗氧化活性肽的研究 2
1.5 活性肽的制备方法 3
1.6 抗氧化活性的评价方法 4
2 实验材料与方法 5
2.1 材料 5
2.2 试剂与仪器 5
2.3 实验方法 6
3 结果与分析 7
3.1酶解温度对DPPH自由基清除率的影响 7
3.2 酶解pH对DPPH自由基清除率的影响 8
3.3 固液比对DPPH自由基清除率的影响 9
3.4 酶用量对DPPH自由基清除率的影响 10
3.5 酶解时间对DPPH自由基清除率的影响 10
3.6 确定最佳酶解方案 11
3.7 正交试验结果及分析 11
3.8 验证试验 13
结论 14
致谢 15
参考文献 16
1 引言
1.1 河蚬简介
河蚬是一种双壳类水生生物又称黄蚬、金蚶、扁螺等，栖息于淡水的湖泊、沟渠、池塘及咸淡水交汇的江河中，广泛分布于我国内陆水域。在俄罗斯、日本、朝鲜、东南亚各国均有分布。其肉味鲜美，营养价值高，经济价值高，具有很好的药用效果。可供食用，也是鱼类、水禽的天然饲料，又为中药药材，也可做为农田肥料。河蚬含七种人体必需氨基酸，其中两种为人体半必需氨基酸，蛋白质含量高于牡蛎、文蛤、翡翠贻贝[1,2]。
1.2 河蚬的生物价值与研究现状
河蚬不但可以作为中药的药材，有开胃、通乳、明目、利尿、去湿毒、治肝 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
病、麻疹退热、止咳化痰、解酒等功效，而且还是禽畜类和鱼类的天然饵料。经过粉碎的蚬肉、蚬壳配入混合饲料 ，饲喂禽畜有促进生长繁殖的作用，可提高禽类产蛋率、畜类产乳率。河蚬也可作为某些特种水产品的鲜活饵科，近几年来，随着鳖、鲤鱼、黄鳝、蟹养殖的发展，人们也开始重视河蚬的养殖。由于河蚬所具有的营养价值，药用价值及食疗价值，对河蚬的开发研究越来越受到国内外专家和学者的关注邱春江等[3]利用木瓜蛋白酶水解花蚬蛋白，得到的酶解物具有很强的清除羟自由基能力。刘杰[4]研究了河蚬酶解液的体外抗氧化作用，发现酶解液具有显著的清除超氧阴离子自由基和羟自由基作用。张磊等[5]探讨了河蚬提取物可能通过抑制脂质过氧化反应对酒精性肝损伤有保护作用。韩鹏等[6]研究了河蚬乙酸乙酯提取物对DPPH自由基具有一定的清除作用。近年来利用可控酶解技术从水产品中制备抗氧化活性肽的研究时有报道，如Je等[7]采用海鱼副产物（如鳕鱼骨架蛋白、青鳕鱼皮胶原蛋白、阿拉斯加青鳕鱼骨架蛋白等）制备出具有抗氧化活性的水解产物；Suetsuna[8]、Wu等[9]分别采用沙丁油鱼、鲭鱼水解得到了鱼类抗氧化肽。
目前，河蚬资源主要以鲜销为主，或者制成蚬干、咸蚬、罐头等粗加工方面，河蚬的鲜销和初级产品远没有发挥其应有的利用潜能，随着我国养殖业的迅猛发展和人工饲养技术的不断提高，河蚬产量的逐年增长也为河蚬抗氧化肽的开发与综合利用提供了丰富的原料来源。
1.3 活性肽简介
生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环状结构的不同肽类的总称，也是源于蛋白质的多功能化合物。
生物活性肽的研究已成为医学中非常活跃的研究领域，随着研究的日趋深入将有更多新的活性肽被发现。由于这些生物活性肽具有分子量小、稳定性强，且免疫原性弱、生物活性高等诸多优点，可以制成各种免疫制剂，用于免疫低下、自身免疫性疾病等的治疗[10]。免疫活性肽具有增强机体免疫力，刺激淋巴细胞增殖，增强巨噬细胞吞噬等多种生理功能，因而具有广阔的应用前景[11]。目前，活性肽的研究领域发展很快，已经受到了各国科学家和政府的高度重视，短短的几年内，就有众多的生物活性肽被辩认出来。有些活性肽已经作为功能性食品实现了工业化生产。生物活性肽的研究与开发作为国际上新兴的生物高科技领域，具有极大市场潜力。
1.4抗氧化活性肽的研究
1.4.1天然抗氧化活性肽
天然抗氧化活性肽是指生物体内源的或由生物体蛋白质降解生成的，具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基产物的活性肽[12]。近几十年来，随着生物技术的进步和生命科学的发展，对活性肽和自由基的研究成为现代生命科学的前沿和热点，很多研究发现蛋白质水解产物具有良好的抗氧化能力[13]（清除除生物体内过量游离基、抑制脂质氧化等)。
同时，一些天然生物活性肽的生理功能也逐渐明确，进一步推动了天然生物活性肽的研究，加之天然生物活性肽本身所具备的安全、低毒、高效等优点，使得评价和筛选具有强抗氧化活性的天然生物活性肽成为国内外科学工作者们较热的研究课题。
目前，人们对天然抗氧化活性肽的研究，已经取得了一定的成果。研究内容主要集中在以多种动物蛋白、植物蛋白等廉价易得的蛋白为原料，通过各种生物、化学和物理等学科的研究方法，分离制备安全、低毒、髙效的天然抗氧化活性肽，并对其序列结构、功能效应、抗氧化机制进行更深层次的研究。
1.4.2 活性肽抗氧化机理
肽类的结构特点和性质(抗氧化活性和高安全性)决定了其是蛋白质类物质中最有前途的抗氧化物质，通过蛋白质的可控酶解技术制备天然的抗氧化肽将能很好地解决由于过多的自由基引起的氧化等问题。利用生物技术生产抗氧化肽的研究已引起了人们的广泛关注。
抗氧化肽的氨基酸构成研究表明，具有较强抗氧化作用的肽相对分子质量一般较小，因此它们易被肠道吸收而直接在机体起作用。但不同原料、不同酶水解所得抗氧化产物其氨基酸构成和排列顺序却有较大差异[14,15]。因此他们的抗氧化机理可能会有不同。目前对肌肽和谷胱甘肽的抗氧化机理研究比较明确，主要表现在能够抑制由金属离子、血红蛋白、脂酶和O2-、OH自由基等催化的脂质氧化，具有有螯合金属离子的能力，特别是对铁及铜离子，同时可以有效的抑制非金属离子催化的脂质过氧化反应[16]。
现阶段，人们对抗氧化肽的活性机理的研究尚未形成理论。但较为清楚的是，活性肽的抗氧化能力与构成活性肽的氨基酸数量、种类、排列顺序、侧链基团等密切相关。蛋白酶解物得到的具有抗氧化活性的肽能抑制机体内自由基的大量积累，对提高自由基清除机制起到一定功效。但对不同来源的抗氧化活性肽的抗氧化机理有待进一步深入研究。
1.5 活性肽的制备方法
1.5.1蛋白酶水解法
酶解法生产活性肽的原料来源广，成本低，安全性高，因而是常用的制备肽的方法[17]。酶的选择主要是针对原料蛋白组成与酶的专一性进行筛选，也可根据活性肽的结构，应用酶工程生产高活性特定酶。酶的选择是生产活性肽的关键。李书国等人[18]研究了酶法生产大豆多肽的加工工艺，分离得到纯净的酸性水解物溶液，水解率高达95%；班玉凤等人[19]研究Alcalase水解大豆蛋白制备大豆蛋白寡肽的方法，确定了酶解的最佳条件，其水解液的水解度达到了24.1%；
1 引言 1
1.1 河蚬简介 1
1.2 河蚬的生物价值与研究现状 1
1.3 活性肽简介 2
1.4抗氧化活性肽的研究 2
1.5 活性肽的制备方法 3
1.6 抗氧化活性的评价方法 4
2 实验材料与方法 5
2.1 材料 5
2.2 试剂与仪器 5
2.3 实验方法 6
3 结果与分析 7
3.1酶解温度对DPPH自由基清除率的影响 7
3.2 酶解pH对DPPH自由基清除率的影响 8
3.3 固液比对DPPH自由基清除率的影响 9
3.4 酶用量对DPPH自由基清除率的影响 10
3.5 酶解时间对DPPH自由基清除率的影响 10
3.6 确定最佳酶解方案 11
3.7 正交试验结果及分析 11
3.8 验证试验 13
结论 14
致谢 15
参考文献 16
1 引言
1.1 河蚬简介
河蚬是一种双壳类水生生物又称黄蚬、金蚶、扁螺等，栖息于淡水的湖泊、沟渠、池塘及咸淡水交汇的江河中，广泛分布于我国内陆水域。在俄罗斯、日本、朝鲜、东南亚各国均有分布。其肉味鲜美，营养价值高，经济价值高，具有很好的药用效果。可供食用，也是鱼类、水禽的天然饲料，又为中药药材，也可做为农田肥料。河蚬含七种人体必需氨基酸，其中两种为人体半必需氨基酸，蛋白质含量高于牡蛎、文蛤、翡翠贻贝[1,2]。
1.2 河蚬的生物价值与研究现状
河蚬不但可以作为中药的药材，有开胃、通乳、明目、利尿、去湿毒、治肝 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: %3^5`1^9`1^6^0`7^2#
病、麻疹退热、止咳化痰、解酒等功效，而且还是禽畜类和鱼类的天然饵料。经过粉碎的蚬肉、蚬壳
目前，河蚬资源主要以鲜销为主，或者制成蚬干、咸蚬、罐头等粗加工方面，河蚬的鲜销和初级产品远没有发挥其应有的利用潜能，随着我国养殖业的迅猛发展和人工饲养技术的不断提高，河蚬产量的逐年增长也为河蚬抗氧化肽的开发与综合利用提供了丰富的原料来源。
1.3 活性肽简介
生物活性肽是指对生物机体的生命活动有益或具有生理作用的肽类化合物，是蛋白质中20个天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环状结构的不同肽类的总称，也是源于蛋白质的多功能化合物。
生物活性肽的研究已成为医学中非常活跃的研究领域，随着研究的日趋深入将有更多新的活性肽被发现。由于这些生物活性肽具有分子量小、稳定性强，且免疫原性弱、生物活性高等诸多优点，可以制成各种免疫制剂，用于免疫低下、自身免疫性疾病等的治疗[10]。免疫活性肽具有增强机体免疫力，刺激淋巴细胞增殖，增强巨噬细胞吞噬等多种生理功能，因而具有广阔的应用前景[11]。目前，活性肽的研究领域发展很快，已经受到了各国科学家
1.4抗氧化活性肽的研究
1.4.1天然抗氧化活性肽
天然抗氧化活性肽是指生物体内源的或由生物体蛋白质降解生成的，具有抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基产物的活性肽[12]。近几十年来，随着生物技术的进步和生命科学的发展，对活性肽和自由基的研究成为现代生命科学的前沿和热点，很多研究发现蛋白质水解产物具有良好的抗氧化能力[13]（清除除生物体内过量游离基、抑制脂质氧化等)。
同时，一些天然生物活性肽的生理功能也逐渐明确，进一步推动了天然生物活性肽的研究，加之天然生物活性肽本身所具备的安全、低毒、高效等优点，使得评价和筛选具有强抗氧化活性的天然生物活性肽成为国内外科学工作者们较热的研究课题。
目前，人们对天然抗氧化活性肽的研究，已经取得了一定的成果。研究内容主要集中在以多种动物蛋白、植物蛋白等廉价易得的蛋白为原料，通过各种生物、化学和物理等学科的研究方法，分离制备安全、低毒、髙效的天然抗氧化活性肽，并对其序列结构、功能效应、抗氧化机制进行更深层次的研究。
1.4.2 活性肽抗氧化机理
肽类的结构特点和性质(抗氧化活性和高安全性)决定了其是蛋白质类物质中最有前途的抗氧化物质，通过蛋白质的可控酶解技术制备天然的抗氧化肽将能很好地解决由于过多的自由基引起的氧化等问题。利用生物技术生产抗氧化肽的研究已引起了人们的广泛关注。
抗氧化肽的氨基酸构成研究表明，具有较强抗氧化作用的肽相对分子质量一般较小，因此它们易被肠道吸收而直接在机体起作用。但不同原料、不同酶水解所得抗氧化产物其氨基酸构成和排列顺序却有较大差异[14,15]。因此他们的抗氧化机理可能会有不同。目前对肌肽和谷胱甘肽的抗氧化机理研究比较明确，主要表现在能够抑制由金属离子、血红蛋白、脂酶和O2-、OH自由基等催化的脂质氧化，具有有螯合金属离子的能力，特别是对铁及铜离子，同时可以有效的抑制非金属离子催化的脂质过氧化反应[16]。
现阶段，人们对抗氧化肽的活性机理的研究尚未形成理论。但较为清楚的是，活性肽的抗氧化能力与构成活性肽的氨基酸数量、种类、排列顺序、侧链基团等密切相关。蛋白酶解物得到的具有抗氧化活性的肽能抑制机体内自由基的大量积累，对提高自由基清除机制起到一定功效。但对不同来源的抗氧化活性肽的抗氧化机理有待进一步深入研究。
1.5 活性肽的制备方法
1.5.1蛋白酶水解法
酶解法生产活性肽的原料来源广，成本低，安全性高，因而是常用的制备肽的方法[17]。酶的选择主要是针对原料蛋白组成与酶的专一性进行筛选，也可根据活性肽的结构，应用酶工程生产高活性特定酶。酶的选择是生产活性肽的关键。李书国等人[18]研究了酶法生产大豆多肽的加工工艺，分离得到纯净的酸性水解物溶液，水解率高达95%；班玉凤等人[19]研究Alcalase水解大豆蛋白制备大豆蛋白寡肽的方法，确定了酶解的最佳条件，其水解液的水解度达到了24.1%；
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