银杏叶黄酮类化合物提取工艺研究(附件)
摘 要银杏叶在临床中使用广泛，主要用于治疗心血管疾病。银杏叶中主要含有黄酮、酯类、多糖、多酚、有机酸和生物碱等活性成分，现代研究表明其具有降血脂、增强免疫力和抗氧化等多种活性。为探讨银杏叶中银杏黄酮的提取工艺研究，以期为银杏叶的开发利用提供一定的参考，本文采用传统的回流提取方法对银杏叶中的黄酮进行了提取，首先通过单因素试验考察了不同乙醇浓度、料液比、提取时间、提取次数、提取温度对黄酮提取的影响，并在此基础上采用四因素三水平正交试验对银杏黄酮提取进行了优化。结果发现银杏叶黄酮最佳提取工艺为：乙醇体积分数为60%、料液比为1:6，在70℃下回流提取40min，提取两次，银杏叶总黄酮提取率为0.77%。结果表明采用回流提取和正交试验进行银杏叶黄酮的提取优化，可以很好的对银杏黄酮进行提取，有利于银杏叶的质量控制和开发利用。目 录
1 引言 7
1.1 银杏叶简介 7
1.2 银杏叶黄酮化合物及其药理活性 7
1.2.1 银杏叶黄酮化合物种类 7
1.2.2银杏叶黄酮药理活性 8
1.3 银杏黄酮提取方法 8
1.3.1有机溶剂提取法 8
1.3.2微波提取法 9
1.3.3超临界萃取法 9
1.3.4酶浸渍萃取法 9
1.3.5超声波辅助提取法 9
1.3.6 大孔树脂吸附法 10
1.3.7细胞和组织培养合成法 10
1.3.8超滤法 10
1.4 研究的目的和意义 11
1.5 研究内容与方法 11
2 实验过程 12
2.1 药材、实验仪器与试剂 12
2.2 银杏叶粉末的制备 12
2.3 银杏黄酮提取方法 13
2.4 标准曲线的绘制 13
2.5 样品中总黄酮的测定 13
2.6 单因素实验 13
2.7 正交实验设计 13
2.8 工艺验证 14
3 结果 15
3.1 标准曲线的绘制 15
3.2 单因素实验 15
3.2.1 料液比对提取率的影响 15<
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^3^5`1^9`1^6^0`7^2#
黄酮提取方法 13
2.4 标准曲线的绘制 13
2.5 样品中总黄酮的测定 13
2.6 单因素实验 13
2.7 正交实验设计 13
2.8 工艺验证 14
3 结果 15
3.1 标准曲线的绘制 15
3.2 单因素实验 15
3.2.1 料液比对提取率的影响 15
3.2.2 乙醇体积分数对提取率的影响 16
3.2.3 提取时间对提取率的影响 17
3.2.4 提取温度对提取率的影响 18
3.2.5提取次数对提取率的影响 18
3.4 正交实验结果 19
3.5 工艺验证结果 20
4 结论与讨论 21
4.1 检测波长的选择 21
4.2 料液比的选择 21
4.3 乙醇浓度的选择 21
4.4 提取时间的选择 21
4.5 提取温度的选择 21
4.6 提取次数的选择 22
4.7 后续试验建议 22
4.8 结论 22
参考文献 23
致谢 26
1 引言
1.1 银杏叶简介
银杏民间俗称白果，是第四纪冰川运动后遗留的裸子植物，十分古老，存活量少，分别较为分散[1]。银杏为1科1属 1 种植物 ，因而有裸子植物“活化石”之称[2]。银杏叶是目前临床使用较广泛的中药材之一[3]，银杏叶提取物也被制成制剂，主要用于治疗心血管疾病[4，5]。银杏叶中主要含有黄酮、酯类、多糖、多酚、有机酸和生物碱等活性成分[68]，现代研究表明其具有降血脂、增强免疫力和抗氧化多重功效[913]。银杏无论在临床应用还是保健类食品开发方面都有广阔的开发前景。
1.2 银杏叶黄酮化合物及其药理活性
1.2.1 银杏叶黄酮化合物种类
研究表明，黄酮类化合物是银杏叶的主要活性成分，其含量为2.5% ~ 5. 91%，银杏叶中黄酮类化合物由黄酮及其苷、双黄酮、儿茶素3类组成[14]。到目前为止银杏中分离出来的黄酮类化合物超过40种，包括黄酮及苷类、单黄酮类、银杏双黄酮和二聚体儿茶素等种类。其中黄酮及苷类28种，主要包括槲皮素及其糖苷、山萘素及其糖苷、异鼠李素及其糖苷、杨梅皮素及其糖苷、木犀草素及其糖苷、洋芹素及其糖苷和桂皮酰黄酮苷。单黄酮类化合物主要包括山萘素葡萄糖苷、槲皮素葡萄糖苷和异鼠李素葡萄糖苷[15]。银杏双黄酮有6种，含有1 3个甲氧基，包括银杏黄素、阿曼托黄素、5′甲氧基白果黄素，此类物质是裸子植物的特征化学成分[16]。此外， 还有二聚体4， 8″儿茶素没食子儿茶素、4， 8″没食子儿茶素没食子儿茶素[17]。
1.2.2银杏叶黄酮药理活性
戴伟等[18]通过喂养4周高脂饲料建立高脂大鼠模型，通过给予高脂大鼠银杏黄酮提取物研究了银杏黄酮降血脂作用。大鼠高脂饲料含有1%胆固醇、10 %猪油、10 %蛋黄粉和79%基础饲料，测定高脂血症大鼠血清脂质和肝脏脂水平。结果发现银杏黄酮具有良好的降血脂作用，能很好的改善胆固醇和甘油三酯代谢。为明确银杏黄酮的有效活性形态，为银杏黄酮作为天然抗氧化剂提供实验依据，张静等[19]研究了苷元型和糖苷型银杏黄酮的抗氧化作用，通过在豆油和鼠脑组织匀浆中加入苷元型和糖苷型银杏黄酮，通过测定高温下添加不同浓度苷元型和糖苷型银杏黄酮对大豆油氧化的抑制效果和丙二醛的抑制效果来进行抗氧作用。结果表明，两种类型的银杏黄酮都可以能有效地抑制脂质氧化（大豆油氧化和DMA抑制）。并且同浓度下，苷元型银杏黄酮具有抗氧化活力更强。张韬等[20]探讨了银杏黄酮对CCl4诱导的小鼠肝损伤的保护作用及其机理。将 60只ICR小鼠随机分为5组，即空白对照组、模型组和银杏黄酮低、中、高剂量组，采用CCl4腹腔注射和灌胃制作小鼠肝损伤模型，通过检测血液中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性、观察肝脏的解剖学形态和病理切片评估其对小鼠肝脏的保护作用。RT PCR检测PXR、CYP3A11、CYP3A13和RXRα的表达。结果发现与空白对照组相比，模型组小鼠血清中ALT和AST活性明显升高，银杏黄酮对四氯化碳所致的小鼠化学性肝损伤具有一定的保护作用。PXR、CYP3A11、CYP3A13和RXRα等基因的激活可能在保护小鼠肝损伤中起到重要作用。刘洪等[21]为观察银杏黄酮对糖尿病肾病（DN）大鼠的肾保护作用和探讨其机制，将40只大鼠随机分为4组，通过左下腹腔注射STZ 60 mg/kg制备糖尿病模型，分别给予氨基胍100 mg/（kgd）、银杏黄酮150 mg/（kgd）和生理盐水，研究了24 h尿白蛋白、体质量、空腹血糖和AGEs等指标并进行电镜观察[22]。结果发现银杏黄酮可降低DN大鼠尿蛋白、减轻肾组织损伤,该作用
1 引言 7
1.1 银杏叶简介 7
1.2 银杏叶黄酮化合物及其药理活性 7
1.2.1 银杏叶黄酮化合物种类 7
1.2.2银杏叶黄酮药理活性 8
1.3 银杏黄酮提取方法 8
1.3.1有机溶剂提取法 8
1.3.2微波提取法 9
1.3.3超临界萃取法 9
1.3.4酶浸渍萃取法 9
1.3.5超声波辅助提取法 9
1.3.6 大孔树脂吸附法 10
1.3.7细胞和组织培养合成法 10
1.3.8超滤法 10
1.4 研究的目的和意义 11
1.5 研究内容与方法 11
2 实验过程 12
2.1 药材、实验仪器与试剂 12
2.2 银杏叶粉末的制备 12
2.3 银杏黄酮提取方法 13
2.4 标准曲线的绘制 13
2.5 样品中总黄酮的测定 13
2.6 单因素实验 13
2.7 正交实验设计 13
2.8 工艺验证 14
3 结果 15
3.1 标准曲线的绘制 15
3.2 单因素实验 15
3.2.1 料液比对提取率的影响 15<
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黄酮提取方法 13
2.4 标准曲线的绘制 13
2.5 样品中总黄酮的测定 13
2.6 单因素实验 13
2.7 正交实验设计 13
2.8 工艺验证 14
3 结果 15
3.1 标准曲线的绘制 15
3.2 单因素实验 15
3.2.1 料液比对提取率的影响 15
3.2.2 乙醇体积分数对提取率的影响 16
3.2.3 提取时间对提取率的影响 17
3.2.4 提取温度对提取率的影响 18
3.2.5提取次数对提取率的影响 18
3.4 正交实验结果 19
3.5 工艺验证结果 20
4 结论与讨论 21
4.1 检测波长的选择 21
4.2 料液比的选择 21
4.3 乙醇浓度的选择 21
4.4 提取时间的选择 21
4.5 提取温度的选择 21
4.6 提取次数的选择 22
4.7 后续试验建议 22
4.8 结论 22
参考文献 23
致谢 26
1 引言
1.1 银杏叶简介
银杏民间俗称白果，是第四纪冰川运动后遗留的裸子植物，十分古老，存活量少，分别较为分散[1]。银杏为1科1属 1 种植物 ，因而有裸子植物“活化石”之称[2]。银杏叶是目前临床使用较广泛的中药材之一[3]，银杏叶提取物也被制成制剂，主要用于治疗心血管疾病[4，5]。银杏叶中主要含有黄酮、酯类、多糖、多酚、有机酸和生物碱等活性成分[68]，现代研究表明其具有降血脂、增强免疫力和抗氧化多重功效[913]。银杏无论在临床应用还是保健类食品开发方面都有广阔的开发前景。
1.2 银杏叶黄酮化合物及其药理活性
1.2.1 银杏叶黄酮化合物种类
研究表明，黄酮类化合物是银杏叶的主要活性成分，其含量为2.5% ~ 5. 91%，银杏叶中黄酮类化合物由黄酮及其苷、双黄酮、儿茶素3类组成[14]。到目前为止银杏中分离出来的黄酮类化合物超过40种，包括黄酮及苷类、单黄酮类、银杏双黄酮和二聚体儿茶素等种类。其中黄酮及苷类28种，主要包括槲皮素及其糖苷、山萘素及其糖苷、异鼠李素及其糖苷、杨梅皮素及其糖苷、木犀草素及其糖苷、洋芹素及其糖苷和桂皮酰黄酮苷。单黄酮类化合物主要包括山萘素葡萄糖苷、槲皮素葡萄糖苷和异鼠李素葡萄糖苷[15]。银杏双黄酮有6种，含有1 3个甲氧基，包括银杏黄素、阿曼托黄素、5′甲氧基白果黄素，此类物质是裸子植物的特征化学成分[16]。此外， 还有二聚体4， 8″儿茶素没食子儿茶素、4， 8″没食子儿茶素没食子儿茶素[17]。
1.2.2银杏叶黄酮药理活性
戴伟等[18]通过喂养4周高脂饲料建立高脂大鼠模型，通过给予高脂大鼠银杏黄酮提取物研究了银杏黄酮降血脂作用。大鼠高脂饲料含有1%胆固醇、10 %猪油、10 %蛋黄粉和79%基础饲料，测定高脂血症大鼠血清脂质和肝脏脂水平。结果发现银杏黄酮具有良好的降血脂作用，能很好的改善胆固醇和甘油三酯代谢。为明确银杏黄酮的有效活性形态，为银杏黄酮作为天然抗氧化剂提供实验依据，张静等[19]研究了苷元型和糖苷型银杏黄酮的抗氧化作用，通过在豆油和鼠脑组织匀浆中加入苷元型和糖苷型银杏黄酮，通过测定高温下添加不同浓度苷元型和糖苷型银杏黄酮对大豆油氧化的抑制效果和丙二醛的抑制效果来进行抗氧作用。结果表明，两种类型的银杏黄酮都可以能有效地抑制脂质氧化（大豆油氧化和DMA抑制）。并且同浓度下，苷元型银杏黄酮具有抗氧化活力更强。张韬等[20]探讨了银杏黄酮对CCl4诱导的小鼠肝损伤的保护作用及其机理。将 60只ICR小鼠随机分为5组，即空白对照组、模型组和银杏黄酮低、中、高剂量组，采用CCl4腹腔注射和灌胃制作小鼠肝损伤模型，通过检测血液中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性、观察肝脏的解剖学形态和病理切片评估其对小鼠肝脏的保护作用。RT PCR检测PXR、CYP3A11、CYP3A13和RXRα的表达。结果发现与空白对照组相比，模型组小鼠血清中ALT和AST活性明显升高，银杏黄酮对四氯化碳所致的小鼠化学性肝损伤具有一定的保护作用。PXR、CYP3A11、CYP3A13和RXRα等基因的激活可能在保护小鼠肝损伤中起到重要作用。刘洪等[21]为观察银杏黄酮对糖尿病肾病（DN）大鼠的肾保护作用和探讨其机制，将40只大鼠随机分为4组，通过左下腹腔注射STZ 60 mg/kg制备糖尿病模型，分别给予氨基胍100 mg/（kgd）、银杏黄酮150 mg/（kgd）和生理盐水，研究了24 h尿白蛋白、体质量、空腹血糖和AGEs等指标并进行电镜观察[22]。结果发现银杏黄酮可降低DN大鼠尿蛋白、减轻肾组织损伤,该作用
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