大豆疫霉效应分子avh241的寄主靶标鉴定
大豆疫霉引起的大豆根茎腐病是大豆的毁灭性病害之一，严重威胁全世界的大豆生产。在侵染植物的过程中，大豆疫霉会分泌大量的效应分子进入寄主体内干扰植物免疫，促进自身侵染。因此，深入探究效应分子干扰植物抗病性的机理，明确大豆疫霉致病的途径以及作用在寄主植物的靶标位点，可以为有效的病害防控策略提供新的思路及方向，同时对设计和改造抗病性有重要意义。本文探究了大豆疫霉效应分子Avh241的功能，通过筛选其寄主靶标，并从中选择候选互作蛋白，利用Co-IP和GST Pull-Down两种技术对其进行了互作验证，成功筛选到Avh241的互作蛋白GmHin1。该研究为进一步理解植物与病原菌的互作机制提供了理论依据。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1．1 供试植物和供试菌株的保存和培养 3
1．2 目标基因的克隆及重组质粒的构建 3
1．2．1 目的基因的克隆 3
1．2．2 重组质粒的构建 3
1．3 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备和转化 4
1．3．1 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 4
1．3．2 热击转化大肠杆菌JM109感受态细胞 4
1．4 大肠杆菌质粒提取 5
1．5 农杆菌GV3101感受态细胞的制备和转化 5
1．5．1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备 5
1．5．2 电击转化农杆菌GV3101感受态细胞 5
1．6 目标基因的植物表达 6
1．6．1 注射烟草用缓冲液的配制(50 mL) 6
1．6．2 注射烟草用缓冲液悬浮农杆菌 6
1．6．3 注射烟草 6
1．7 植物蛋白的提取 6
1．8 蛋白样品Western 验证 7
1．9 蛋白互作验证 7
1．9．1 植物体内免疫共沉淀技术（CoIP） 7
1．9．2 蛋白质PullDown技术 8
2 结果与分析 9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
2．1 重组质粒pBinGFPAvh241的构建 9
2．2 候选互作蛋白筛选结果 10
2．3 Avh241候选互作蛋白的克隆及重组质粒的构建 11
2．4 CoIP体内互作验证 12
2．5 GST PullDown体外互作验证 13
3 讨论 13
致谢 14
参考文献： 14
附录1 Avh241、GmHin1核苷酸序列 16
附录2 质谱测序结果 17
附录3 用于构建载体的引物序列 19
大豆疫霉效应分子Avh241的寄主靶标鉴定
引言
大豆属于世界范围内重要的一类经济油料作物，在中国，大豆以及大豆制品在人们日常生活中是不可缺少的。大豆疫霉（Phytophthora sojae）属于卵菌疫霉属，是一种半活体营养型病原菌，能在农业上造成长期危害。其中，它引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，可以对大豆的生产造成极其严重的损失，由大豆疫霉导致的全球直接经济损失每年可高达十几亿美元[1]。在我国，大豆疫霉还属于检疫性有害生物。目前，防治大豆疫病主要通过培育抗病品种，药剂处理种子等方法[2]。
在漫长的进化过程中，植物与病原微生物彼此在不断地相互选择，协同进化。双方通过相互施加压力，不断进化和适应，慢慢发展出了属于各自的一套复杂的抗侵染与侵染的遗传机制[3]。植物对病原菌的抗性可以分为两个层次，即植物识别病原菌的保守分子模式PAMP (Pathogenassociated molecular pattern) 产生的先天免疫PTI (PAMP triggered immunity) 和识别效应分子产生的ETI (Effectorstriggered immunity)[4]。因此，植物病原菌的成功侵染，需要克服多重障碍。在进入植物细胞之前，病原微生物需要经过植物中具有多种植物免疫系统防卫成分的质外体区域。位于植物细胞膜表面的受体(patternrecognition receptors,PRRs) 能够识别病程相关分子模式，从而产生由PAMP引起的免疫反应，以阻止病原菌的侵入定殖 [5]。而成功入侵的病原菌则会分泌大量的效应分子(Effectors) 到植物细胞中去，攻击这种依赖于PRR的免疫反应，进而通过调控植物的免疫反应以促进其对寄主营养的掠夺，促进自身的侵染与定殖。在这个过程中，植物自身能够进化抗病基因来识别这些效应分子，从而再对植物病原菌产生相应的防卫反应，即效应分子触发的免疫反应 [4]。
在这种长期的相互斗争过程中，为抑制植物的免疫反应，病原物往往会分泌大量的效应分子到植物细胞的不同部位，以破坏或者延缓寄主的免疫反应。植物病原物分泌的效应分子是多种多样的，它包括：胞外病原细菌通过三型分泌系统 (Type III secretion system, T3SS) 向寄主细胞内分泌的三型效应分子 (Type Ⅲ effectors, T3SEs)；蚜虫和线虫在取食过程中分泌到植物细胞的唾液蛋白；卵菌和真菌通过吸器侵入到寄主细胞分泌的效应分子[6]。
同绝大多数的动植物病原菌一样，植物病原卵菌也会在侵染寄主植物的过程中分泌大量效应分子进入寄主细胞，通过破坏或者干扰细胞代谢途径，从而促进自身的侵入和定殖。目前在植物病原卵菌中已经发现了多种效应分子，其中包括分泌到植物质外体的NLP和Elicitin等家族(Apoplastic effectors)以及分泌到植物细胞内的RxLR和CRN等家族(Cytoplasmic effectors)[6] 。随着植物病原卵菌基因组测序的不断发展，通过生物信息学的比对，一类卵菌中大量存在的独特的效应分子在疫霉的基因组中被发现。这一类效应分子都具有一个共同的特点，即在这些效应分子的N端都含有一个信号肽，其后紧随着一个保守的RxLRdEER motif，因而这类效应分子被称为RxLR效应分子。RxLR效应分子的大小通常为100到300个氨基酸。目前这类效应分子仅在植物病原卵菌中有发现，而且其数量很庞大。研究发现，在大豆疫霉的基因组中存在着将近400个编码 RxLR 效应分子的基因，这些效应分子可以通过RxLR motif与植物细胞膜上的PI3P结合，从而帮助其进入寄主细胞内发挥作用[7]。然而，关于这些RxLR效应分子在侵染大豆的过程中具体的作用机制，我们仍然所知甚少。
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Key words 1
引言 1
1 材料与方法 3
1．1 供试植物和供试菌株的保存和培养 3
1．2 目标基因的克隆及重组质粒的构建 3
1．2．1 目的基因的克隆 3
1．2．2 重组质粒的构建 3
1．3 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备和转化 4
1．3．1 大肠杆菌JM109感受态细胞的制备 4
1．3．2 热击转化大肠杆菌JM109感受态细胞 4
1．4 大肠杆菌质粒提取 5
1．5 农杆菌GV3101感受态细胞的制备和转化 5
1．5．1 农杆菌GV3101感受态细胞的制备 5
1．5．2 电击转化农杆菌GV3101感受态细胞 5
1．6 目标基因的植物表达 6
1．6．1 注射烟草用缓冲液的配制(50 mL) 6
1．6．2 注射烟草用缓冲液悬浮农杆菌 6
1．6．3 注射烟草 6
1．7 植物蛋白的提取 6
1．8 蛋白样品Western 验证 7
1．9 蛋白互作验证 7
1．9．1 植物体内免疫共沉淀技术（CoIP） 7
1．9．2 蛋白质PullDown技术 8
2 结果与分析 9 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
2．1 重组质粒pBinGFPAvh241的构建 9
2．2 候选互作蛋白筛选结果 10
2．3 Avh241候选互作蛋白的克隆及重组质粒的构建 11
2．4 CoIP体内互作验证 12
2．5 GST PullDown体外互作验证 13
3 讨论 13
致谢 14
参考文献： 14
附录1 Avh241、GmHin1核苷酸序列 16
附录2 质谱测序结果 17
附录3 用于构建载体的引物序列 19
大豆疫霉效应分子Avh241的寄主靶标鉴定
引言
大豆属于世界范围内重要的一类经济油料作物，在中国，大豆以及大豆制品在人们日常生活中是不可缺少的。大豆疫霉（Phytophthora sojae）属于卵菌疫霉属，是一种半活体营养型病原菌，能在农业上造成长期危害。其中，它引起的大豆根茎腐病是威胁全世界大豆生产的毁灭性病害之一，可以对大豆的生产造成极其严重的损失，由大豆疫霉导致的全球直接经济损失每年可高达十几亿美元[1]。在我国，大豆疫霉还属于检疫性有害生物。目前，防治大豆疫病主要通过培育抗病品种，药剂处理种子等方法[2]。
在漫长的进化过程中，植物与病原微生物彼此在不断地相互选择，协同进化。双方通过相互施加压力，不断进化和适应，慢慢发展出了属于各自的一套复杂的抗侵染与侵染的遗传机制[3]。植物对病原菌的抗性可以分为两个层次，即植物识别病原菌的保守分子模式PAMP (Pathogenassociated molecular pattern) 产生的先天免疫PTI (PAMP triggered immunity) 和识别效应分子产生的ETI (Effectorstriggered immunity)[4]。因此，植物病原菌的成功侵染，需要克服多重障碍。在进入植物细胞之前，病原微生物需要经过植物中具有多种植物免疫系统防卫成分的质外体区域。位于植物细胞膜表面的受体(patternrecognition receptors,PRRs) 能够识别病程相关分子模式，从而产生由PAMP引起的免疫反应，以阻止病原菌的侵入定殖 [5]。而成功入侵的病原菌则会分泌大量的效应分子(Effectors) 到植物细胞中去，攻击这种依赖于PRR的免疫反应，进而通过调控植物的免疫反应以促进其对寄主营养的掠夺，促进自身的侵染与定殖。在这个过程中，植物自身能够进化抗病基因来识别这些效应分子，从而再对植物病原菌产生相应的防卫反应，即效应分子触发的免疫反应 [4]。
在这种长期的相互斗争过程中，为抑制植物的免疫反应，病原物往往会分泌大量的效应分子到植物细胞的不同部位，以破坏或者延缓寄主的免疫反应。植物病原物分泌的效应分子是多种多样的，它包括：胞外病原细菌通过三型分泌系统 (Type III secretion system, T3SS) 向寄主细胞内分泌的三型效应分子 (Type Ⅲ effectors, T3SEs)；蚜虫和线虫在取食过程中分泌到植物细胞的唾液蛋白；卵菌和真菌通过吸器侵入到寄主细胞分泌的效应分子[6]。
同绝大多数的动植物病原菌一样，植物病原卵菌也会在侵染寄主植物的过程中分泌大量效应分子进入寄主细胞，通过破坏或者干扰细胞代谢途径，从而促进自身的侵入和定殖。目前在植物病原卵菌中已经发现了多种效应分子，其中包括分泌到植物质外体的NLP和Elicitin等家族(Apoplastic effectors)以及分泌到植物细胞内的RxLR和CRN等家族(Cytoplasmic effectors)[6] 。随着植物病原卵菌基因组测序的不断发展，通过生物信息学的比对，一类卵菌中大量存在的独特的效应分子在疫霉的基因组中被发现。这一类效应分子都具有一个共同的特点，即在这些效应分子的N端都含有一个信号肽，其后紧随着一个保守的RxLRdEER motif，因而这类效应分子被称为RxLR效应分子。RxLR效应分子的大小通常为100到300个氨基酸。目前这类效应分子仅在植物病原卵菌中有发现，而且其数量很庞大。研究发现，在大豆疫霉的基因组中存在着将近400个编码 RxLR 效应分子的基因，这些效应分子可以通过RxLR motif与植物细胞膜上的PI3P结合，从而帮助其进入寄主细胞内发挥作用[7]。然而，关于这些RxLR效应分子在侵染大豆的过程中具体的作用机制，我们仍然所知甚少。
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