纳米银的多元醇法制备及抗菌活性评价
纳米银的多元醇法制备及抗菌活性评价[20200507190448]
摘要：本文旨在使用改良的多元醇法制备生物相容性好的纳米银，并评价纳米银对多种细菌的抗菌活性。该法分别以聚乙二醇4000（PEG4000）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为还原剂和稳定剂。制备的纳米银通过紫外-可见分光光谱仪、动态光散射仪和透射电子显微镜进行表征，发现纳米银的尺寸分布均一、分散性良好。通过微量肉汤稀释法测定纳米银对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的抗菌活性，结果显示纳米银对革兰氏阴性菌的抗菌活性强于革兰氏阳性菌，但它们的MIC值均较高。因此，有必要改变纳米银的理化性质，如尺寸、表面化学和表面电荷等，以提高其抗菌活性。
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关键字:纳米银；多元醇法；制备；表征；抗菌活性
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.1.1实验试剂3
1.1.2实验仪器3
1.2实验方法 3
1.2.1多元醇法进行纳米银的制备3
1.2.2纳米银的表征4
1.2.3纳米银的抗菌活性实验（MIC测定）5
2结果与分析5
2.1纳米银的实物图5
2.2纳米银的紫外-可见光吸收光谱图6
2.3透射电镜图6
2.4粒径大小分布图7
2.5水动力尺寸和表面电荷7
2.6 MIC值8
3讨论 8
致谢9
参考文献9
纳米银的多元醇法制备及抗菌活性评价
引言
细菌多药耐药性（multidrug-resistant,MDR）已成为一个棘手的全球公共健康问题，其对人类生命健康的威胁绝不亚于艾滋病、癌症和心血管疾病[1]。银作为一种无机抗菌剂有着非常悠久的应用历史，如感染治疗、水源净化、防腐用银器等。然而，银离子稳定性差，且毒性较大，使其在抗生素被发现以后的应用逐渐减少,但是银与磺胺嘧啶结合形成的磺胺嘧啶银至今仍用于外伤感染的治疗。近年来纳米技术迅速发展，使其在医学、生物学和环境保护等领域具有广泛的应用前景。纳米技术与银这一中古老的药物相结合时，会为解决细菌多药耐药性问题提供一种新的途径[2]。 由于理化性质独特，纳米化的银表现出不同于银离子的生物学性质[3]。银粒子进行纳米化后不但可降低其对真核细胞的毒性，而且对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌仍具有很强的抗 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
菌作用，尤其对多药耐药菌具有较强的抗菌作用，且不易产生耐药性，被视为治疗多药耐药菌，包括铜绿假单胞菌、耐氨苄西林大肠杆菌、耐红霉素化脓链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）等难治性病原菌的强有力潜在武器[4]。此外，纳米银在抗真菌、抗病毒、抗生物被膜、抗炎和促进伤口愈合等方面也具有良好的应用潜力[5]。因此，纳米银在多药耐药病原菌感染、细菌和真菌的混合感染、不明病因的体外和局部皮肤感染、外科手术感染等疾病的治疗上具有一般抗生素无法比拟的独特优势。
众所周知，银是动物体内的微量元素之一，微量使用是对机体无害的，其中WHO规定人体内的银安全含量为0.05 μg/kg。尽管纳米化降低了银的毒性，但大量研究报道纳米银的细胞毒性依然存在，仍然是细胞毒性较强的材料之一[6]，人们一直在讨论如何降低细胞毒性和提高抗菌活性，因此纳米银的绿色合成越来越受到研究者的重视。而且绿色合成理念制备的纳米银不仅具有良好的生物相容性好，也表现出良好的抗多药耐药菌作用。因为绿色合成法必须满足以下三个方面：（1）选择可溶解的介质；（2）选择环境友好型的还原剂；（3）选择无毒物质作为稳定剂。纳米银作为商业化最高的一种材料，近年来其制备方法得到了快速发展，一般分为物理法合成法、化学法合成法和生物合成法三类，每一种方法都有其优缺点。其中化学合成法是应用最为广泛的方法，也是一种极为简便的纳米银溶液制备方法。多元醇法是一种基于绿色理念的化学合成法，是以乙二醇等多元醇作为反应的溶剂和还原剂，在合适的稳定剂保护下，通过加热还原硝酸银来制备纳米银颗粒 [7] 。多元醇法制备纳米银具有反应速度快、粒径可控、尺寸梯度大、纯化过程简单等优点。传统多元醇法以乙二醇作为还原剂制备多种粒径的纳米银，且调节方法也相对简单。鉴于纳米银的广泛生物医学应用，在乙二醇的基础上，发展了以聚乙二醇作为还原剂制备纳米银的方法。聚乙二醇作为药用辅料，具有环境友好、无毒、生物可降解等优点，被广泛用于液体制剂，如口服液、滴眼液等。而PVP具有良好的水溶性、低毒性、化学稳定性和生物相容性等优点，因此在生物医学领域应用广泛，可用于药物载体、血浆替代品以及化妆品等。因此，本研究采用PEG4000作为还原剂，PVP作为保护剂，制备具有良好生物相容性的纳米银。该法制备条件简单、可行，成本低，对环境污染小。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验试剂
聚乙二醇4000（PEG4000，分析纯） 国药集团化学试剂有限公司
聚乙烯吡咯烷酮（PVP-K30，分析纯） 阿拉丁试剂（上海）有限公司
硝酸银（AgNO3，分析纯） 国药集团化学试剂有限公司
乙醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司
丙酮（分析纯） 上海凌峰化学试剂有限公司
MH培养基 上海盛思生化科技有限公司
1.1.2 实验仪器
恒温磁力搅拌器（85-2） 江苏金坛医疗仪器厂
精密电子控制仪（ZNHW-Ⅱ型） 杭州大卫科教仪器有限公司
超声波清洗器（KQ-250E） 昆山市超声仪器有限公司
高速冷冻离心机（5804R） 德国（Eppendorf）公司
透射电子显微镜（ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
TEM，JEM-200CX） 日本JEOL公司
紫外-可见分光光光度计 上海光谱仪器有限公司
立式压力蒸汽灭菌器（LB-B5OL） 上海华线医用核子仪器有限公司
数显鼓风干燥箱（GZX-9240 MBE） 上海博迅实业有限公司医疗设备
洁净工作台（SW-CJ-1F） 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司
电子分析天平（BSA224S） 赛多利斯科科学仪器（北京）有限公司
隔水式恒温培养箱（GRP-9160） 上海森信试验仪器有限公司
动态光散射仪（DLS） 英国马尔文仪器公司
1.2 实验方法
1.2.1多元醇法进行纳米银的制备
整个实验过程中所使用的玻璃仪器都需要用单蒸水冲洗干净，烘干后才能使用,且反应是在130 ℃进行。架好实验装置后，在三口烧瓶上接冷凝管，然后分别加入0.5 g的PEG4000、0.3 g的PVP和20 mL的单蒸水。配以磁力转子，油浴加热，且中速磁力搅拌。另取0.1 g的硝酸银结晶于5 mL单蒸水，用移液枪或注射器充分吹打，使其完全溶解。待上述混合溶液温度到达130，溶解完全后，用移液枪滴加硝酸银溶液于三口烧瓶中。反应持续4 h，室温冷却。溶液以黄色泛绿为上佳。中途观察溶液颜色、气泡是否过多，可按情况微调转速[8]。
1.2.2 纳米银的表征
纳米银的理化性质可通过多种仪器进行表征，如透射电子显微镜TEM、扫描电子显微镜SEM、原子力显微镜AFM、动态光散射仪DLS、X射线电子光谱仪XRS、X射线衍射仪XRD、傅里叶变换红外分光镜FTIR、紫外-可见分光光谱仪UV-vis等[9]。本实验采用TEM、UV-vis和DLS对纳米银的粒径、形貌和溶液中的分散性等进行表征。
为了准确评价纳米银的抗菌活性，需对制备的纳米银进行处理，以去除未反应的银离子、PEG4000和PVP等。具体处理步骤如下：将所制备的纳米银分批移入1 mL 离心管中，以6000 r/min离心5 min。取出上清液，留待二次离心，沉淀收集。上清液二次离心的操作与一次离心基本一致，换以8000 r/min离心5 min即可，收集沉淀。用适量的单蒸水稀释初次浓缩好的纳米银，再次4000 r/min离心5 min，至上清夜透明为止，收集沉淀，适量的单蒸水稀释后再以0.02 μm的微孔滤膜过滤，避光保存，留待下一步表征和抗菌活性评价。
摘要：本文旨在使用改良的多元醇法制备生物相容性好的纳米银，并评价纳米银对多种细菌的抗菌活性。该法分别以聚乙二醇4000（PEG4000）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）作为还原剂和稳定剂。制备的纳米银通过紫外-可见分光光谱仪、动态光散射仪和透射电子显微镜进行表征，发现纳米银的尺寸分布均一、分散性良好。通过微量肉汤稀释法测定纳米银对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和粪肠球菌的抗菌活性，结果显示纳米银对革兰氏阴性菌的抗菌活性强于革兰氏阳性菌，但它们的MIC值均较高。因此，有必要改变纳米银的理化性质，如尺寸、表面化学和表面电荷等，以提高其抗菌活性。
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关键字:纳米银；多元醇法；制备；表征；抗菌活性
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关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法3
1.1实验材料 3
1.1.1实验试剂3
1.1.2实验仪器3
1.2实验方法 3
1.2.1多元醇法进行纳米银的制备3
1.2.2纳米银的表征4
1.2.3纳米银的抗菌活性实验（MIC测定）5
2结果与分析5
2.1纳米银的实物图5
2.2纳米银的紫外-可见光吸收光谱图6
2.3透射电镜图6
2.4粒径大小分布图7
2.5水动力尺寸和表面电荷7
2.6 MIC值8
3讨论 8
致谢9
参考文献9
纳米银的多元醇法制备及抗菌活性评价
引言
细菌多药耐药性（multidrug-resistant,MDR）已成为一个棘手的全球公共健康问题，其对人类生命健康的威胁绝不亚于艾滋病、癌症和心血管疾病[1]。银作为一种无机抗菌剂有着非常悠久的应用历史，如感染治疗、水源净化、防腐用银器等。然而，银离子稳定性差，且毒性较大，使其在抗生素被发现以后的应用逐渐减少,但是银与磺胺嘧啶结合形成的磺胺嘧啶银至今仍用于外伤感染的治疗。近年来纳米技术迅速发展，使其在医学、生物学和环境保护等领域具有广泛的应用前景。纳米技术与银这一中古老的药物相结合时，会为解决细菌多药耐药性问题提供一种新的途径[2]。 由于理化性质独特，纳米化的银表现出不同于银离子的生物学性质[3]。银粒子进行纳米化后不但可降低其对真核细胞的毒性，而且对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌仍具有很强的抗 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
菌作用，尤其对多药耐药菌具有较强的抗菌作用，且不易产生耐药性，被视为治疗多药耐药菌，包括铜绿假单胞菌、耐氨苄西林大肠杆菌、耐红霉素化脓链球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和耐万古霉素金黄色葡萄球菌（VRSA）等难治性病原菌的强有力潜在武器[4]。此外，纳米银在抗真菌、抗病毒、抗生物被膜、抗炎和促进伤口愈合等方面也具有良好的应用潜力[5]。因此，纳米银在多药耐药病原菌感染、细菌和真菌的混合感染、不明病因的体外和局部皮肤感染、外科手术感染等疾病的治疗上具有一般抗生素无法比拟的独特优势。
众所周知，银是动物体内的微量元素之一，微量使用是对机体无害的，其中WHO规定人体内的银安全含量为0.05 μg/kg。尽管纳米化降低了银的毒性，但大量研究报道纳米银的细胞毒性依然存在，仍然是细胞毒性较强的材料之一[6]，人们一直在讨论如何降低细胞毒性和提高抗菌活性，因此纳米银的绿色合成越来越受到研究者的重视。而且绿色合成理念制备的纳米银不仅具有良好的生物相容性好，也表现出良好的抗多药耐药菌作用。因为绿色合成法必须满足以下三个方面：（1）选择可溶解的介质；（2）选择环境友好型的还原剂；（3）选择无毒物质作为稳定剂。纳米银作为商业化最高的一种材料，近年来其制备方法得到了快速发展，一般分为物理法合成法、化学法合成法和生物合成法三类，每一种方法都有其优缺点。其中化学合成法是应用最为广泛的方法，也是一种极为简便的纳米银溶液制备方法。多元醇法是一种基于绿色理念的化学合成法，是以乙二醇等多元醇作为反应的溶剂和还原剂，在合适的稳定剂保护下，通过加热还原硝酸银来制备纳米银颗粒 [7] 。多元醇法制备纳米银具有反应速度快、粒径可控、尺寸梯度大、纯化过程简单等优点。传统多元醇法以乙二醇作为还原剂制备多种粒径的纳米银，且调节方法也相对简单。鉴于纳米银的广泛生物医学应用，在乙二醇的基础上，发展了以聚乙二醇作为还原剂制备纳米银的方法。聚乙二醇作为药用辅料，具有环境友好、无毒、生物可降解等优点，被广泛用于液体制剂，如口服液、滴眼液等。而PVP具有良好的水溶性、低毒性、化学稳定性和生物相容性等优点，因此在生物医学领域应用广泛，可用于药物载体、血浆替代品以及化妆品等。因此，本研究采用PEG4000作为还原剂，PVP作为保护剂，制备具有良好生物相容性的纳米银。该法制备条件简单、可行，成本低，对环境污染小。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验试剂
聚乙二醇4000（PEG4000，分析纯） 国药集团化学试剂有限公司
聚乙烯吡咯烷酮（PVP-K30，分析纯） 阿拉丁试剂（上海）有限公司
硝酸银（AgNO3，分析纯） 国药集团化学试剂有限公司
乙醇（分析纯） 国药集团化学试剂有限公司
丙酮（分析纯） 上海凌峰化学试剂有限公司
MH培养基 上海盛思生化科技有限公司
1.1.2 实验仪器
恒温磁力搅拌器（85-2） 江苏金坛医疗仪器厂
精密电子控制仪（ZNHW-Ⅱ型） 杭州大卫科教仪器有限公司
超声波清洗器（KQ-250E） 昆山市超声仪器有限公司
高速冷冻离心机（5804R） 德国（Eppendorf）公司
透射电子显微镜（ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3 5 1 9 1 6 0 7 2
TEM，JEM-200CX） 日本JEOL公司
紫外-可见分光光光度计 上海光谱仪器有限公司
立式压力蒸汽灭菌器（LB-B5OL） 上海华线医用核子仪器有限公司
数显鼓风干燥箱（GZX-9240 MBE） 上海博迅实业有限公司医疗设备
洁净工作台（SW-CJ-1F） 苏净集团苏州安泰空气技术有限公司
电子分析天平（BSA224S） 赛多利斯科科学仪器（北京）有限公司
隔水式恒温培养箱（GRP-9160） 上海森信试验仪器有限公司
动态光散射仪（DLS） 英国马尔文仪器公司
1.2 实验方法
1.2.1多元醇法进行纳米银的制备
整个实验过程中所使用的玻璃仪器都需要用单蒸水冲洗干净，烘干后才能使用,且反应是在130 ℃进行。架好实验装置后，在三口烧瓶上接冷凝管，然后分别加入0.5 g的PEG4000、0.3 g的PVP和20 mL的单蒸水。配以磁力转子，油浴加热，且中速磁力搅拌。另取0.1 g的硝酸银结晶于5 mL单蒸水，用移液枪或注射器充分吹打，使其完全溶解。待上述混合溶液温度到达130，溶解完全后，用移液枪滴加硝酸银溶液于三口烧瓶中。反应持续4 h，室温冷却。溶液以黄色泛绿为上佳。中途观察溶液颜色、气泡是否过多，可按情况微调转速[8]。
1.2.2 纳米银的表征
纳米银的理化性质可通过多种仪器进行表征，如透射电子显微镜TEM、扫描电子显微镜SEM、原子力显微镜AFM、动态光散射仪DLS、X射线电子光谱仪XRS、X射线衍射仪XRD、傅里叶变换红外分光镜FTIR、紫外-可见分光光谱仪UV-vis等[9]。本实验采用TEM、UV-vis和DLS对纳米银的粒径、形貌和溶液中的分散性等进行表征。
为了准确评价纳米银的抗菌活性，需对制备的纳米银进行处理，以去除未反应的银离子、PEG4000和PVP等。具体处理步骤如下：将所制备的纳米银分批移入1 mL 离心管中，以6000 r/min离心5 min。取出上清液，留待二次离心，沉淀收集。上清液二次离心的操作与一次离心基本一致，换以8000 r/min离心5 min即可，收集沉淀。用适量的单蒸水稀释初次浓缩好的纳米银，再次4000 r/min离心5 min，至上清夜透明为止，收集沉淀，适量的单蒸水稀释后再以0.02 μm的微孔滤膜过滤，避光保存，留待下一步表征和抗菌活性评价。
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