carbanp法用于产碳青酶烯酶不动杆菌的检测
目的探讨将Carba NP法用于产碳青酶烯酶不动杆菌的检测。方法将28株产碳青霉烯酶菌株作为研究对象，采用Carba NP法进行碳青霉烯酶检测，并将其与改良Hodge试验比较，采用PCR方法检测碳青霉烯酶基因（NMC、IMI、SME、KPC、GES、IMP、VIM、OXA），并与Carba NP法的结果相比较。结果 Carba NP试验I能够快速检测菌株是否产碳青霉烯酶，Carba NP试验Ⅱ能进一步判定产碳青酶烯酶菌株的组别。其检测方法较改良的Hodge试验更简单、快速。PCR检测出的耐药基因主要为OXA-23，IMP检出3株，VIM检出1株，即待测菌产生的为B组和D组碳青酶烯酶，与Carba NP法结果一致，说明Carba NP法能够特异、灵敏地检测产碳青霉烯酶菌株。结论 Carba NP法操作快速、简单，而且能够特异、灵敏地检测产碳青霉烯酶菌株。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1主要试剂与耗材4
1.2试剂与仪器4
1.3菌种来源4
1.4检测液成分4
1.5 Carba NP实验4
1.5.1预实验5
1.5.2 Carba NP试验I5
1.5.3 Carba NP试验II5
1.6改良Hodge试验法5
1.7耐药基因检测5
2结果与分析7
2.1预实验7
2.2 Carba NP试验I7
2.3 Carba NP试验II8
2.4改良Hodge试验法9
2.5耐药基因检测9
3讨论 9
3．1 Carba NP试验与改良Hodge试验比较10
3.2 Carba NP试验与PCR基因检测10
致谢11
参考文献11
图1 CarbAcineto NP实验流程图6
表1 碳青酶烯酶耐药基因引物序列5
Carba NP法用于产碳青酶烯酶不动杆菌的检测 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
引言
引言
近年来，随着免疫抑制、肿瘤、结核病人的日益增加以及抗生素的大量使用，多重耐药的不动杆菌的临床检出率逐年上升，尤其在免疫抑制及危重病人中检出率可高达80%90%，其中耐碳青霉烯类抗生素的不动杆菌在ICU、血液科、呼吸科及老年科的检出率甚至高达50%。由于碳青霉烯类抗生素是治疗革兰阴性杆菌引起感染最有效的抗菌药物，细菌一旦出现碳青霉烯类药物耐药，将对患者生命构成了极大的威胁，给临床治疗带来了严峻的挑战。由此产碳青霉烯酶的革兰阴性杆菌的耐药表型及基因型的检测成为临床研究的热点，其中不动杆菌因其特殊的高耐药性成为研究的难点。
目前检测革兰阴性杆菌碳青霉烯酶的方法有改良Hodge试验（MHT）、亚胺培南EDTA双纸片协同试验，此外还有基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDIT0FMS）检测耐药酶、基于聚合酶链反应的分子生物学技术及基因芯片技术检测耐药基因等方法。改良Hodge试验是美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的肠杆菌科细菌的产碳青霉烯酶表型的确认实验，但是改良Hodge试验耗时、特异性差（高产AmpC酶的干扰）以及敏感度低（B组及D组碳青霉烯酶、产NDM型酶阳性率极低）；亚胺培南EDTA双纸片协同试验仅用来检测B组碳青霉烯酶；MALDIT0FMS法和PCR法虽然特异性和敏感性较高但仪器昂贵，在普通实验室中无法常规开展。
因此，深入研究并建立高灵敏度和特异性的快速检测革兰阴性杆菌，尤其是不动杆菌碳青霉烯酶的方法、不仅具有较高的学术价值，更具有广阔的临床应用前景。本研究拟建立CarbAcineto NP试验方法在快速检测产碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌中的临床应用价值。
1 材料与方法
1．1 主要试剂与耗材
亚胺培南西司他丁钠（杭州默沙东制药有限公司）、
他唑巴坦（中国药品生物制品检定研究院）、
0.5（mol/L）EDTA（上海生工生物工程有限公司）、
细菌总蛋白抽提试剂（Thermo公司）、
酚红（Amresco公司）、
硫酸锌七水合物（美国sigma公司）。
主要耗材为EP管（美国Corning公司）
1．2试剂与仪器
菌种鉴定及MIC法药敏采用法国生物梅里埃公司Vitek2 Compact全自动细菌鉴定系统进行检测。厄他培南及美洛培南纸片购自美国默沙东公司；多黏菌素和替加环素E试验条购自法国生物梅里埃公司；MH琼脂、MH肉汤购自科玛嘉公司。
1．3菌种来源
收集2012年1月至2015年无锡市第二人民医院临床分离对亚胺培南、美罗培南均耐药的不动杆菌细菌28株。
1．4检测液成分
检测液A：每毫升0.5%酚红溶液（pH7.0～7.8）中含有终浓度为8 mg/mL的亚胺培南/西司他丁钠，0.1 mmol/L ZnSO4 。
检测液B：每毫升0.5%酚红溶液（pH 7．0～7.8）中含有终浓度为8 mg/mL的亚胺培南/西司他丁钠，0.1 mmol/L ZnSO4和4 mg/mL他唑巴坦。
检测液C：每毫升0.5% 酚红溶液（pH7．0～7.8）中含有终浓度为8 mg/ml 的亚胺培南/西司他丁钠和0．003 mol/L EDTA。
检测液D: 0.5% 酚红溶液（pH7.0～7.8）。
1．5 Carba NP实验
Carba NP法直接采用细菌细胞裂解后的蛋白抽提液（酶粗提物）与亚胺培南进行反应，碳青霉烯酶能水解碳青酶烯类药物，使其开环，开环的同时伴随H的产生，当H累计到一定浓度，可使检测液中的酸碱指示剂（酚红）变色，用肉眼即可辨别此颜色变化，从而推测菌株是否产碳青酶烯酶。Carba NP试验分Carba NP试验I和Carba NP试验II，Carba NP试验I结果可判断菌株是否产碳青霉烯酶， CarbaNP试验Ⅱ根据不同组别酶抑制剂的不同，在Carba NP试验I的基础上增设2个检测孔，以进一步判定产碳青酶烯酶菌株的组别。
1.5.1预实验Carba NP实验方法的建立如图表1所示
a.选取已知耐药表型的菌株及敏感菌株进行预实验。
b.用722分光光度计调制不同OD值的菌液，菌液OD值分别为0.5、1、2、4、8、16、32、64，试验体积要求在100ul左右。
c.混悬于100L蒸馏水中，涡旋震荡器上剧烈振荡1、2、4、8、16、30min后，室温静置20～30 min，加入100 ul检测液，并用移液器吹打混匀。
d.置于37℃孵箱，每0.5 h观察记录颜色变化至孵育1 h结束。
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摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）3
1 材料与方法4
1.1主要试剂与耗材4
1.2试剂与仪器4
1.3菌种来源4
1.4检测液成分4
1.5 Carba NP实验4
1.5.1预实验5
1.5.2 Carba NP试验I5
1.5.3 Carba NP试验II5
1.6改良Hodge试验法5
1.7耐药基因检测5
2结果与分析7
2.1预实验7
2.2 Carba NP试验I7
2.3 Carba NP试验II8
2.4改良Hodge试验法9
2.5耐药基因检测9
3讨论 9
3．1 Carba NP试验与改良Hodge试验比较10
3.2 Carba NP试验与PCR基因检测10
致谢11
参考文献11
图1 CarbAcineto NP实验流程图6
表1 碳青酶烯酶耐药基因引物序列5
Carba NP法用于产碳青酶烯酶不动杆菌的检测 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
引言
引言
近年来，随着免疫抑制、肿瘤、结核病人的日益增加以及抗生素的大量使用，多重耐药的不动杆菌的临床检出率逐年上升，尤其在免疫抑制及危重病人中检出率可高达80%90%，其中耐碳青霉烯类抗生素的不动杆菌在ICU、血液科、呼吸科及老年科的检出率甚至高达50%。由于碳青霉烯类抗生素是治疗革兰阴性杆菌引起感染最有效的抗菌药物，细菌一旦出现碳青霉烯类药物耐药，将对患者生命构成了极大的威胁，给临床治疗带来了严峻的挑战。由此产碳青霉烯酶的革兰阴性杆菌的耐药表型及基因型的检测成为临床研究的热点，其中不动杆菌因其特殊的高耐药性成为研究的难点。
目前检测革兰阴性杆菌碳青霉烯酶的方法有改良Hodge试验（MHT）、亚胺培南EDTA双纸片协同试验，此外还有基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDIT0FMS）检测耐药酶、基于聚合酶链反应的分子生物学技术及基因芯片技术检测耐药基因等方法。改良Hodge试验是美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的肠杆菌科细菌的产碳青霉烯酶表型的确认实验，但是改良Hodge试验耗时、特异性差（高产AmpC酶的干扰）以及敏感度低（B组及D组碳青霉烯酶、产NDM型酶阳性率极低）；亚胺培南EDTA双纸片协同试验仅用来检测B组碳青霉烯酶；MALDIT0FMS法和PCR法虽然特异性和敏感性较高但仪器昂贵，在普通实验室中无法常规开展。
因此，深入研究并建立高灵敏度和特异性的快速检测革兰阴性杆菌，尤其是不动杆菌碳青霉烯酶的方法、不仅具有较高的学术价值，更具有广阔的临床应用前景。本研究拟建立CarbAcineto NP试验方法在快速检测产碳青霉烯酶的鲍曼不动杆菌中的临床应用价值。
1 材料与方法
1．1 主要试剂与耗材
亚胺培南西司他丁钠（杭州默沙东制药有限公司）、
他唑巴坦（中国药品生物制品检定研究院）、
0.5（mol/L）EDTA（上海生工生物工程有限公司）、
细菌总蛋白抽提试剂（Thermo公司）、
酚红（Amresco公司）、
硫酸锌七水合物（美国sigma公司）。
主要耗材为EP管（美国Corning公司）
1．2试剂与仪器
菌种鉴定及MIC法药敏采用法国生物梅里埃公司Vitek2 Compact全自动细菌鉴定系统进行检测。厄他培南及美洛培南纸片购自美国默沙东公司；多黏菌素和替加环素E试验条购自法国生物梅里埃公司；MH琼脂、MH肉汤购自科玛嘉公司。
1．3菌种来源
收集2012年1月至2015年无锡市第二人民医院临床分离对亚胺培南、美罗培南均耐药的不动杆菌细菌28株。
1．4检测液成分
检测液A：每毫升0.5%酚红溶液（pH7.0～7.8）中含有终浓度为8 mg/mL的亚胺培南/西司他丁钠，0.1 mmol/L ZnSO4 。
检测液B：每毫升0.5%酚红溶液（pH 7．0～7.8）中含有终浓度为8 mg/mL的亚胺培南/西司他丁钠，0.1 mmol/L ZnSO4和4 mg/mL他唑巴坦。
检测液C：每毫升0.5% 酚红溶液（pH7．0～7.8）中含有终浓度为8 mg/ml 的亚胺培南/西司他丁钠和0．003 mol/L EDTA。
检测液D: 0.5% 酚红溶液（pH7.0～7.8）。
1．5 Carba NP实验
Carba NP法直接采用细菌细胞裂解后的蛋白抽提液（酶粗提物）与亚胺培南进行反应，碳青霉烯酶能水解碳青酶烯类药物，使其开环，开环的同时伴随H的产生，当H累计到一定浓度，可使检测液中的酸碱指示剂（酚红）变色，用肉眼即可辨别此颜色变化，从而推测菌株是否产碳青酶烯酶。Carba NP试验分Carba NP试验I和Carba NP试验II，Carba NP试验I结果可判断菌株是否产碳青霉烯酶， CarbaNP试验Ⅱ根据不同组别酶抑制剂的不同，在Carba NP试验I的基础上增设2个检测孔，以进一步判定产碳青酶烯酶菌株的组别。
1.5.1预实验Carba NP实验方法的建立如图表1所示
a.选取已知耐药表型的菌株及敏感菌株进行预实验。
b.用722分光光度计调制不同OD值的菌液，菌液OD值分别为0.5、1、2、4、8、16、32、64，试验体积要求在100ul左右。
c.混悬于100L蒸馏水中，涡旋震荡器上剧烈振荡1、2、4、8、16、30min后，室温静置20～30 min，加入100 ul检测液，并用移液器吹打混匀。
d.置于37℃孵箱，每0.5 h观察记录颜色变化至孵育1 h结束。
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