VHL22、APP、CamkIIα-Cre转基因小鼠模型的建立
VHL22、APP、CamkIIα-Cre转基因小鼠模型的建立[20200507220356]
摘要：阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种由神经系统变性引发的退行性疾病，其病理学特征主要包括β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)的沉积、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)和神经元的广泛丢失。Aβ前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)是与AD的发生密切相关的一型跨膜蛋白，通过β分泌酶途径切割可产生Aβ。VHL蛋白是一种肿瘤抑制因子，本实验室已有的研究结果表明VHL能在细胞水平抑制Aβ的产生，是APP的一个新的调控分子。为了进一步研究VHL对APP和Aβ的调节作用，本实验通过将VHL2/2小鼠、CamkIIα-Cre 转基因小鼠以及阿尔茨海默病模型小鼠（APP转基因小鼠，点突变的APP是早发性AD的主要病因）进行交配，建立VHL2/2条件性基因敲除小鼠模型。一星期内进行3次腹腔注射Tamoxifen诱导Cre酶表达，敲除VHL基因，并通过western blot检测VHL基因敲除效果。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:VHL；Aβ前体蛋白(APP)；阿尔兹海默病(AD)；β-淀粉样蛋白(Aβ)
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）4
1 材料与方法8
1.1 材料 8
1.1.1 材料8
1.1.2 试剂配置8
1.2 方法 8
1.2.1 实验动物及采样8
1.2.2 Tamoxifen的配置及注射方法10
1.2.3蛋白样品的制备11
1.2.4 Western blotting11
2 结果与分析12
2.1 小鼠的一般状况12
2.2 VHL在野生型小鼠中各组织的分布12
2.3 VHL2/2、CamkIIα-Cre、APP 转基因小鼠基因型的鉴定12
2.4 Cre酶诱导后VHL2/2的敲除效果13
3 讨论 13
致谢15
参考文献15
VHL2/2、APP 、CamkIIα-Cre转基因小鼠模型的建立
动物医学院 张东慧
引言
阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种由神经系统变性引发的进行性痴呆，1906年，德国医生兼神经病理学家 Alois Alzheimer首次在55岁的女性病人中发现该病并命名为阿尔兹海默病。该病以大脑皮层颞叶和额叶萎缩为显著特征，典型的三大病理特征为：胞外老年斑、胞内的神经原纤维缠结(NFTs)以及神经元的广泛缺失1,2。NFTs主要是由过度磷酸化扭曲成丝状的微管相关蛋白Tau形成，而老年斑的主要成分是Aβ (β-amyloid)。AD的临床表现以精神症状以及行为方面 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
的异常为主，病程可长达数年至数十年。随着人口老龄化程度的加剧，世界范围内有两千万AD患者，中国目前约有500万AD患者，AD已经成为继心血管疾病、肿瘤和脑卒中之后的第4位杀手。美国神经学会预测，如果没有进行预防措施，全世界阿尔兹海默症患者数目将在2050年达到1亿。
淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)是一种跨膜蛋白，在AD发病机制中起着十分重要的作用。APP与APLP1（APP like protein 1）和APLP2（APP like protein 2）属于同一蛋白家族，Aβ结构域是APP蛋白特有的，除此之外还有E1和E2等胞外保守的结构域。对APP在小鼠中的敲除发现，APP同源物之间具有功能的冗余性。但在小鼠中对APP、APLP1、APLP2三者不同的组合敲除发现，当APP或者APLP1敲除时，APLP2的敲除是致死的3。至APP发现以来，人们已经进行了大量研究，APP不仅仅与Aβ的产生有关，还参与神经突起生长、突触形成、神经蛋白沿轴突转运、跨膜信号的转导、细胞粘连和钙离子调控等等，但关于其详细生理功能仍有待进一步阐明4。
APP在膜上的水解有两条途径，主要取决于APP在细胞膜上发生内吞或是直接在细胞膜上发生α分泌酶的切割（见图1）。经内吞后的APP大部分定位于内体-溶酶体系统，被β分泌酶在Aβ的第1位天冬氨酸前面进行切割，暴露Aβ的N端，并向胞外释放sAPPβ，余下的跨膜的CTFβ则被γ分泌酶切割，暴露Aβ的C端，由此产生Aβ，Aβ通过循环途径释放到胞外或在溶酶体降解，释放到胞外的Aβ对AD的进程有着十分重要的作用，可见APP的内吞与Aβ的产生密切相关。现在的观点认为Aβ的沉积能够通过激活GSK-3β（glycogen synthase kinase-3β）导致Tau蛋白的过度磷酸化，而Aβ的沉积和Tau蛋白的过度磷酸化促进老年斑和NFTs形成，最后使学习和记忆能力受损。在细胞膜表面未发生内吞的APP，被α分泌酶在Aβ内部第16位和第17位氨基酸之间进行切割，破坏了Aβ的结构，向胞外分泌sAPPα，并产生一个含有88个氨基酸的跨膜蛋白C末端片段（CTFα），CTFα被γ分泌酶水解，产生一个P3小片段和APP的胞内结构域（APP intracellular domain, AICD），其中sAPPα具有神经营养和神经保护的作用，可以看到该过程并不产生Aβ5-9。有趣的是，APP与它的水解产物CTFs，反过来也可以调节细胞膜表面γ分泌酶的转运，而对于β分泌酶没有作用3。
图1.APP细胞膜上的切割（引自OBrien, R.J., and Wong, P.C. 2011）
上述水解途径中经β分泌酶和γ分泌酶产生的Aβ可导致突触功能紊乱、NFTs的形成、神经元丢失一系列级联反应，因此形成了AD典型的三大病理特征。其中Aβ40和Aβ42是Aβ最为常见的两种形式，两者均有毒性，其中Aβ42更疏水，更易促进NFTs形成，占Aβ总量的10%。在familial AD (FAD)中，伴随有Aβ42/Aβ40比例的升高，表明相对于Aβ40的水平，Aβ42的升高对AD的发展十分重要。
尽管Aβ主要分布在细胞外，但在内质网、高尔基体/TGN、内体/溶酶体也存在。研究发现，在海马和大脑皮质中，胞内的Aβ特别是Aβ42，能够产生炎症反应，导致AD的早期症状- *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
轻微的认知障碍（mild cognitive impairment ，MCI）。在唐氏综合征 (Down Syndrome，DS) 病人中发现，胞内的Aβ能够促进胞外Aβ淀粉斑的形成。可见，胞内的Aβ沉积是神经退行性疾病的早期症状，当胞内Aβ水平降低时，胞外Aβ淀粉斑便开始形成10。同时，胞内的Aβ还可以通过ERK/MAPK信号通路影响杏仁核依赖的情绪反应。可以看到，过量的Aβ对神经有毒性，但是少量的Aβ可以提高海马区的长时程增强作用（long term potentiation，LTP）、提高记忆。多种动物的体液中均含有可溶性的Aβ，也表明Aβ具有重要的生理作用11。
APP的两条水解途径都可以产生AICD，值得注意的是，经APP水解产生的AICD也具有转录调节活性，它的过度产生能够引起AD疾病相关的生理功能的紊乱，研究发现γ分泌酶的一种调节药物-CHF5074 (Chiesi Pharmaceuticals) 能够与AICD结合降低其转录调节活性，从而降低了组蛋白H3的乙酰化水平和AICD的靶基因KAI1的转录水平。同时，CHF5074能改变APP的剪切，使Aβ42转变为低毒性的Aβ38，从而能够降低过度磷酸化的Tau蛋白的沉积12,13。CHF5074是第一种被证明可调节小胶质细胞的化合物，小胶质细胞是大脑的第一道免疫细胞，淀粉样斑块可能会刺激其产生炎性化合物，而炎症反应与AD的病程和进展相关。实验化合物 CHF5074旨在通过改变小胶质细胞活动来抑制炎症，研究显示其能够在AD疾病小鼠模型中预防淀粉样斑块的形成和减少功能障碍。
尽管对AD的发病机制有一定的了解，关于AD治疗的药物研究正在不断深入，但是目前关于AD的治疗还没有十分有效的方法，大麻类药物、磷酸二酯酶抑制剂、噻唑烷二酮、神经生长因子、5-HT6受体拮抗剂、经颅磁刺激（TMS）等正在被深入研究，有望成为治疗AD的有效药物14,15。临床常使用胆碱酯酶抑制剂以及改善脑代谢的药物，还有免疫疗法、胰高血糖素样肽（GLP-1）、食品鸡尾酒疗法等，但这些治疗方法只能在一定程度上改善一些症状，没有明显的治疗效果1。
摘要：阿尔兹海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种由神经系统变性引发的退行性疾病，其病理学特征主要包括β-淀粉样蛋白(β-amyloid，Aβ)的沉积、神经元纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)和神经元的广泛丢失。Aβ前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)是与AD的发生密切相关的一型跨膜蛋白，通过β分泌酶途径切割可产生Aβ。VHL蛋白是一种肿瘤抑制因子，本实验室已有的研究结果表明VHL能在细胞水平抑制Aβ的产生，是APP的一个新的调控分子。为了进一步研究VHL对APP和Aβ的调节作用，本实验通过将VHL2/2小鼠、CamkIIα-Cre 转基因小鼠以及阿尔茨海默病模型小鼠（APP转基因小鼠，点突变的APP是早发性AD的主要病因）进行交配，建立VHL2/2条件性基因敲除小鼠模型。一星期内进行3次腹腔注射Tamoxifen诱导Cre酶表达，敲除VHL基因，并通过western blot检测VHL基因敲除效果。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
关键字:VHL；Aβ前体蛋白(APP)；阿尔兹海默病(AD)；β-淀粉样蛋白(Aβ)
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论）4
1 材料与方法8
1.1 材料 8
1.1.1 材料8
1.1.2 试剂配置8
1.2 方法 8
1.2.1 实验动物及采样8
1.2.2 Tamoxifen的配置及注射方法10
1.2.3蛋白样品的制备11
1.2.4 Western blotting11
2 结果与分析12
2.1 小鼠的一般状况12
2.2 VHL在野生型小鼠中各组织的分布12
2.3 VHL2/2、CamkIIα-Cre、APP 转基因小鼠基因型的鉴定12
2.4 Cre酶诱导后VHL2/2的敲除效果13
3 讨论 13
致谢15
参考文献15
VHL2/2、APP 、CamkIIα-Cre转基因小鼠模型的建立
动物医学院 张东慧
引言
阿尔兹海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种由神经系统变性引发的进行性痴呆，1906年，德国医生兼神经病理学家 Alois Alzheimer首次在55岁的女性病人中发现该病并命名为阿尔兹海默病。该病以大脑皮层颞叶和额叶萎缩为显著特征，典型的三大病理特征为：胞外老年斑、胞内的神经原纤维缠结(NFTs)以及神经元的广泛缺失1,2。NFTs主要是由过度磷酸化扭曲成丝状的微管相关蛋白Tau形成，而老年斑的主要成分是Aβ (β-amyloid)。AD的临床表现以精神症状以及行为方面 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
的异常为主，病程可长达数年至数十年。随着人口老龄化程度的加剧，世界范围内有两千万AD患者，中国目前约有500万AD患者，AD已经成为继心血管疾病、肿瘤和脑卒中之后的第4位杀手。美国神经学会预测，如果没有进行预防措施，全世界阿尔兹海默症患者数目将在2050年达到1亿。
淀粉样蛋白前体蛋白(amyloid precursor protein，APP)是一种跨膜蛋白，在AD发病机制中起着十分重要的作用。APP与APLP1（APP like protein 1）和APLP2（APP like protein 2）属于同一蛋白家族，Aβ结构域是APP蛋白特有的，除此之外还有E1和E2等胞外保守的结构域。对APP在小鼠中的敲除发现，APP同源物之间具有功能的冗余性。但在小鼠中对APP、APLP1、APLP2三者不同的组合敲除发现，当APP或者APLP1敲除时，APLP2的敲除是致死的3。至APP发现以来，人们已经进行了大量研究，APP不仅仅与Aβ的产生有关，还参与神经突起生长、突触形成、神经蛋白沿轴突转运、跨膜信号的转导、细胞粘连和钙离子调控等等，但关于其详细生理功能仍有待进一步阐明4。
APP在膜上的水解有两条途径，主要取决于APP在细胞膜上发生内吞或是直接在细胞膜上发生α分泌酶的切割（见图1）。经内吞后的APP大部分定位于内体-溶酶体系统，被β分泌酶在Aβ的第1位天冬氨酸前面进行切割，暴露Aβ的N端，并向胞外释放sAPPβ，余下的跨膜的CTFβ则被γ分泌酶切割，暴露Aβ的C端，由此产生Aβ，Aβ通过循环途径释放到胞外或在溶酶体降解，释放到胞外的Aβ对AD的进程有着十分重要的作用，可见APP的内吞与Aβ的产生密切相关。现在的观点认为Aβ的沉积能够通过激活GSK-3β（glycogen synthase kinase-3β）导致Tau蛋白的过度磷酸化，而Aβ的沉积和Tau蛋白的过度磷酸化促进老年斑和NFTs形成，最后使学习和记忆能力受损。在细胞膜表面未发生内吞的APP，被α分泌酶在Aβ内部第16位和第17位氨基酸之间进行切割，破坏了Aβ的结构，向胞外分泌sAPPα，并产生一个含有88个氨基酸的跨膜蛋白C末端片段（CTFα），CTFα被γ分泌酶水解，产生一个P3小片段和APP的胞内结构域（APP intracellular domain, AICD），其中sAPPα具有神经营养和神经保护的作用，可以看到该过程并不产生Aβ5-9。有趣的是，APP与它的水解产物CTFs，反过来也可以调节细胞膜表面γ分泌酶的转运，而对于β分泌酶没有作用3。
图1.APP细胞膜上的切割（引自OBrien, R.J., and Wong, P.C. 2011）
上述水解途径中经β分泌酶和γ分泌酶产生的Aβ可导致突触功能紊乱、NFTs的形成、神经元丢失一系列级联反应，因此形成了AD典型的三大病理特征。其中Aβ40和Aβ42是Aβ最为常见的两种形式，两者均有毒性，其中Aβ42更疏水，更易促进NFTs形成，占Aβ总量的10%。在familial AD (FAD)中，伴随有Aβ42/Aβ40比例的升高，表明相对于Aβ40的水平，Aβ42的升高对AD的发展十分重要。
尽管Aβ主要分布在细胞外，但在内质网、高尔基体/TGN、内体/溶酶体也存在。研究发现，在海马和大脑皮质中，胞内的Aβ特别是Aβ42，能够产生炎症反应，导致AD的早期症状- *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
轻微的认知障碍（mild cognitive impairment ，MCI）。在唐氏综合征 (Down Syndrome，DS) 病人中发现，胞内的Aβ能够促进胞外Aβ淀粉斑的形成。可见，胞内的Aβ沉积是神经退行性疾病的早期症状，当胞内Aβ水平降低时，胞外Aβ淀粉斑便开始形成10。同时，胞内的Aβ还可以通过ERK/MAPK信号通路影响杏仁核依赖的情绪反应。可以看到，过量的Aβ对神经有毒性，但是少量的Aβ可以提高海马区的长时程增强作用（long term potentiation，LTP）、提高记忆。多种动物的体液中均含有可溶性的Aβ，也表明Aβ具有重要的生理作用11。
APP的两条水解途径都可以产生AICD，值得注意的是，经APP水解产生的AICD也具有转录调节活性，它的过度产生能够引起AD疾病相关的生理功能的紊乱，研究发现γ分泌酶的一种调节药物-CHF5074 (Chiesi Pharmaceuticals) 能够与AICD结合降低其转录调节活性，从而降低了组蛋白H3的乙酰化水平和AICD的靶基因KAI1的转录水平。同时，CHF5074能改变APP的剪切，使Aβ42转变为低毒性的Aβ38，从而能够降低过度磷酸化的Tau蛋白的沉积12,13。CHF5074是第一种被证明可调节小胶质细胞的化合物，小胶质细胞是大脑的第一道免疫细胞，淀粉样斑块可能会刺激其产生炎性化合物，而炎症反应与AD的病程和进展相关。实验化合物 CHF5074旨在通过改变小胶质细胞活动来抑制炎症，研究显示其能够在AD疾病小鼠模型中预防淀粉样斑块的形成和减少功能障碍。
尽管对AD的发病机制有一定的了解，关于AD治疗的药物研究正在不断深入，但是目前关于AD的治疗还没有十分有效的方法，大麻类药物、磷酸二酯酶抑制剂、噻唑烷二酮、神经生长因子、5-HT6受体拮抗剂、经颅磁刺激（TMS）等正在被深入研究，有望成为治疗AD的有效药物14,15。临床常使用胆碱酯酶抑制剂以及改善脑代谢的药物，还有免疫疗法、胰高血糖素样肽（GLP-1）、食品鸡尾酒疗法等，但这些治疗方法只能在一定程度上改善一些症状，没有明显的治疗效果1。
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