mtt法快速测定副猪嗜血杆菌活菌数试验
：在制备副猪嗜血杆菌疫苗的接种抗原时，常用平板计数法测量培养一定时间后的副猪嗜血杆菌活菌数，以判断是否达到制备抗原所需滴度。但由于平板计数法耗时较长，可能引起培养物中细菌活力下降或菌体死亡，从而降低抗原效果。为了快速测定副猪嗜血杆菌培养物中活菌数，以达到快速检测和及时制备接种抗原，本试验采用MTT法进行活菌数检测。MTT全称为3-(4，5-二甲基噻唑-2）-2,5-二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞不产生琥珀酸脱氢酶，通过MTT法、平板计数法、分光光度计法在内的三种方法联合建立甲瓒生成量、活菌数、菌体总数的关系。本试验在利用MTT法快速检测活菌数方面进行了探索。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1菌株、血清、器材设备及主要试剂2
1.1.1菌株及血清2
1.1.2主要试剂2
1.2试验准备2
1.2.1菌种的活化和种子培养基的制备2
1.2.2细菌培养2
1.3 副猪嗜血杆菌计数试验2
1.3.1试验材料 2
1.3.2平板计数法2
1.3.2.1试验原理3
1.3.2.2试验方法3
1.3.2.3菌落计数3
1.3.3比浊法检测OD600吸光值3
1.3.3.1 试验方法3
1.3.4MTT法检测活菌数4
1.3.4.1试验原理4
1.3.4.2试验方法 5
2 试验结果5
2.1数据统计5
2.2比较与分析5
3讨论 5
致谢5
参考文献6
MTT法快速测定副猪嗜血杆菌活菌数试验
庞博1，刘茂军2
大学 动物医学院，江苏 南京 210095；
2.江苏省农业科学院兽医研究所，江苏 南京 210014）
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
引言：副猪嗜血杆菌可以引起猪的传染性多关节炎、多浆膜炎，该病在全世界均有发生，近10年来此病在规模化猪场的感染率和所致的死亡率日益增高，已成为危害养猪业较严重的细菌性疾病之一[1,2]，及时、准确地诊断出该病以便采取相应的措施是成功防制该病的关键[3]。在制备接种动物的抗原前，需要测量制备好的培养物中副猪嗜血杆菌活菌数是否达到制备抗原所需滴度，常用的平板计数法因其耗时较长[4]，活菌数准确度偏低[5]，检测期间可能引起制备好的培养物中菌体活力下降或者死亡裂解等因素，可能使抗原效果下降。为了快速测定副猪嗜血杆菌培养物中活菌数，减少因平板计数法测量活菌数耗时带来的抗原性质改变，以达到快速检测以及及时制备接种抗原，本试验采用MTT法[613]进行活菌数检测。MTT全称为3(4，5二甲基噻唑2）2,5二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞不产生琥珀酸脱氢酶，因此用DMSO（二甲基亚砜）溶解生成的甲臜，利用光密度值变化可间接反应活细胞增殖量[4]，此法广泛用于免疫细胞及动物细胞的活性检测[14]。现报告如下:
1 材料与方法
1．1 菌株、血清、器材设备及主要试剂
1.1.1 菌株及血清
副猪嗜血杆菌标准株：HS80（5型）、SW124（4型）、HS1079（13型）；分离株FS（4型），分离株NR4型，分离株XX型，均由江苏省农业科学院兽医研究所家畜重大疫病防制研究室保存。
1.1.2 器材设备
微量移液器及移液枪头、试管、离心机、96孔微量凝集反应板、水浴锅、分光光度蛋白仪、摇床、37℃温箱、超净台。
1.1.3 主要试剂
副猪嗜血杆菌疫苗培养基、琼脂、小牛血清、NAD辅酶、DMSO（二甲基亚砜）、MTT（3(4，5二甲基噻唑2）2,5）二苯基四氮唑溴盐等试剂均由江苏省农科院兽医研究所家畜重大疫病防制研究室购入和配制。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种的活化和种子培养基的制备
将冻干保存的副猪嗜血杆菌SW124型329代接种于TSA培养基，37℃培养24h；挑取单菌落，接入TSB培养基，37℃、180r/min摇床培养24h进行增殖作为种子待用。
1.2.2 细菌培养
将在TSB培养基中增殖好的菌种按照1%的比例接种于液体培养基（ 即500uL SW124329代菌液接种在5mL副猪嗜血杆菌液体培养基中），37℃、180r/min条件下培养。从第16h、19h、22h、25h、28h、31h每个时间点分别进行MTT、CFU及OD600测定。
编号
1
2
3
4
5
6
时间（h）
16
19
22
25
28
31
1.3 副猪嗜血杆菌计数试验
试验流程：将每个时间点得到而的副猪嗜血杆菌样品，以三种方法(平板计数法、MTT法、分光光度计法)测定其细菌数量。
1.3.1 材料
菌种：副猪嗜血杆菌SW124330代按照试验设定的每个时间点取出新鲜培养物；
试剂：TSA平板、TSB液体培养基、PBS、MTT、DMSO；
仪器：酒精灯、无菌刻度吸管、微量移液器、接种环、记号笔、西林瓶、tip头、试管、1.5mL EP管、96孔微量反应板、10mL离心管。
1.3.2 平板计数法
1.3.2.1实验原理
平皿菌落计数法是将定量的含菌样品经过稀释后，与培养基混合制成平板，样品中所含的单细胞微生物（如菌体、芽孢、孢子）被各自分散固定在固体平板的不同位置上，经过培养，每个有生命力的细胞均可繁殖形成一个肉眼可见的菌落。统计平板上菌落数就可以推算出样品中活菌量的多少。
1.3.2.2 试验方法
TSA平板、西林瓶和试管编号：①取无菌5ml西林瓶8个，分别用记号笔依次标明SW124101、SW124102、SW124103、SW124104、SW124105、SW124106、SW124107、SW124108。②取9块副猪嗜血杆菌TSA平板分别标记为 SW124106、SW124107、SW124108，每个稀释度3个重复。每个西林瓶中分别加入4.5ml的TSB培养基；从第16h开始，每个时间点用无菌tip头准确吸取500ul待测菌液加入101标号的西林瓶中；另取1支无菌tip头将101标号西林瓶中的菌悬液吹吸均匀（反复吹吸10—20次），再准确量取500ul悬液加入102标号的西林瓶中；依此类推进行10倍系列稀释，将菌悬液稀释到108。用9支无菌tip头分别准确吸取106(x3)、107(x3)、108(x3)的稀释液各200ul，按照编号加入相应编号的TSA平板涂匀后，置于37℃恒温箱中培养48h。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料与方法2
1.1菌株、血清、器材设备及主要试剂2
1.1.1菌株及血清2
1.1.2主要试剂2
1.2试验准备2
1.2.1菌种的活化和种子培养基的制备2
1.2.2细菌培养2
1.3 副猪嗜血杆菌计数试验2
1.3.1试验材料 2
1.3.2平板计数法2
1.3.2.1试验原理3
1.3.2.2试验方法3
1.3.2.3菌落计数3
1.3.3比浊法检测OD600吸光值3
1.3.3.1 试验方法3
1.3.4MTT法检测活菌数4
1.3.4.1试验原理4
1.3.4.2试验方法 5
2 试验结果5
2.1数据统计5
2.2比较与分析5
3讨论 5
致谢5
参考文献6
MTT法快速测定副猪嗜血杆菌活菌数试验
庞博1，刘茂军2
大学 动物医学院，江苏 南京 210095；
2.江苏省农业科学院兽医研究所，江苏 南京 210014）
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072*
引言：副猪嗜血杆菌可以引起猪的传染性多关节炎、多浆膜炎，该病在全世界均有发生，近10年来此病在规模化猪场的感染率和所致的死亡率日益增高，已成为危害养猪业较严重的细菌性疾病之一[1,2]，及时、准确地诊断出该病以便采取相应的措施是成功防制该病的关键[3]。在制备接种动物的抗原前，需要测量制备好的培养物中副猪嗜血杆菌活菌数是否达到制备抗原所需滴度，常用的平板计数法因其耗时较长[4]，活菌数准确度偏低[5]，检测期间可能引起制备好的培养物中菌体活力下降或者死亡裂解等因素，可能使抗原效果下降。为了快速测定副猪嗜血杆菌培养物中活菌数，减少因平板计数法测量活菌数耗时带来的抗原性质改变，以达到快速检测以及及时制备接种抗原，本试验采用MTT法[613]进行活菌数检测。MTT全称为3(4，5二甲基噻唑2）2,5二苯基四氮唑溴盐，商品名为噻唑蓝。其原理是利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲臜并沉积在细胞中，而死细胞不产生琥珀酸脱氢酶，因此用DMSO（二甲基亚砜）溶解生成的甲臜，利用光密度值变化可间接反应活细胞增殖量[4]，此法广泛用于免疫细胞及动物细胞的活性检测[14]。现报告如下:
1 材料与方法
1．1 菌株、血清、器材设备及主要试剂
1.1.1 菌株及血清
副猪嗜血杆菌标准株：HS80（5型）、SW124（4型）、HS1079（13型）；分离株FS（4型），分离株NR4型，分离株XX型，均由江苏省农业科学院兽医研究所家畜重大疫病防制研究室保存。
1.1.2 器材设备
微量移液器及移液枪头、试管、离心机、96孔微量凝集反应板、水浴锅、分光光度蛋白仪、摇床、37℃温箱、超净台。
1.1.3 主要试剂
副猪嗜血杆菌疫苗培养基、琼脂、小牛血清、NAD辅酶、DMSO（二甲基亚砜）、MTT（3(4，5二甲基噻唑2）2,5）二苯基四氮唑溴盐等试剂均由江苏省农科院兽医研究所家畜重大疫病防制研究室购入和配制。
1.2 试验方法
1.2.1 菌种的活化和种子培养基的制备
将冻干保存的副猪嗜血杆菌SW124型329代接种于TSA培养基，37℃培养24h；挑取单菌落，接入TSB培养基，37℃、180r/min摇床培养24h进行增殖作为种子待用。
1.2.2 细菌培养
将在TSB培养基中增殖好的菌种按照1%的比例接种于液体培养基（ 即500uL SW124329代菌液接种在5mL副猪嗜血杆菌液体培养基中），37℃、180r/min条件下培养。从第16h、19h、22h、25h、28h、31h每个时间点分别进行MTT、CFU及OD600测定。
编号
1
2
3
4
5
6
时间（h）
16
19
22
25
28
31
1.3 副猪嗜血杆菌计数试验
试验流程：将每个时间点得到而的副猪嗜血杆菌样品，以三种方法(平板计数法、MTT法、分光光度计法)测定其细菌数量。
1.3.1 材料
菌种：副猪嗜血杆菌SW124330代按照试验设定的每个时间点取出新鲜培养物；
试剂：TSA平板、TSB液体培养基、PBS、MTT、DMSO；
仪器：酒精灯、无菌刻度吸管、微量移液器、接种环、记号笔、西林瓶、tip头、试管、1.5mL EP管、96孔微量反应板、10mL离心管。
1.3.2 平板计数法
1.3.2.1实验原理
平皿菌落计数法是将定量的含菌样品经过稀释后，与培养基混合制成平板，样品中所含的单细胞微生物（如菌体、芽孢、孢子）被各自分散固定在固体平板的不同位置上，经过培养，每个有生命力的细胞均可繁殖形成一个肉眼可见的菌落。统计平板上菌落数就可以推算出样品中活菌量的多少。
1.3.2.2 试验方法
TSA平板、西林瓶和试管编号：①取无菌5ml西林瓶8个，分别用记号笔依次标明SW124101、SW124102、SW124103、SW124104、SW124105、SW124106、SW124107、SW124108。②取9块副猪嗜血杆菌TSA平板分别标记为 SW124106、SW124107、SW124108，每个稀释度3个重复。每个西林瓶中分别加入4.5ml的TSB培养基；从第16h开始，每个时间点用无菌tip头准确吸取500ul待测菌液加入101标号的西林瓶中；另取1支无菌tip头将101标号西林瓶中的菌悬液吹吸均匀（反复吹吸10—20次），再准确量取500ul悬液加入102标号的西林瓶中；依此类推进行10倍系列稀释，将菌悬液稀释到108。用9支无菌tip头分别准确吸取106(x3)、107(x3)、108(x3)的稀释液各200ul，按照编号加入相应编号的TSA平板涂匀后，置于37℃恒温箱中培养48h。
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