假孕大鼠黄体退化过程中p-ERK12表达研究
假孕大鼠黄体退化过程中p-ERK12表达研究[2020051004]
摘要：研究大鼠卵巢黄体退化过程中MAPK通路成员p-ERK1/2的变化规律，探讨其在PGF诱导黄体退化中的作用及机理。将未成年雌性28日龄SD大鼠注射25 IU孕马血清促性腺激素（PMSG），48 h后注射25 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）建立假孕模型（D0）。D7注射一定量的前列腺素类似物氯前列烯醇或生理盐水，分别在0min、10min、30min、1h、2h、4h处死大鼠，收集卵巢。一侧卵巢-80℃冻存，采用Western Blot检测p-ERK1/2表达量；另一侧卵巢用多聚甲醛固定用于石蜡切片，观察卵巢的组织结构。运用Western Blot技术检测发现p-ERK1/2在PGF类似物氯前列烯醇处理后10 min表达，至30min表达水平达到最高，然后60min时表达水平降低。p-ERK1/2在PGF诱导的大鼠黄体退化过程中可能具有一定作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:黄体退化；PGF；p-ERK
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 试验材料 2
1.1.1 试验动物 2
1.1.2 试验器材 2
1.1.3 试验试剂 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 取材与固定 2
1.2.2 样品处理 2
1.2.3 HE染色 2
1.2.4 Western Blot 3
1.2.5 统计方法 3
2 结果 3
2.1 假孕大鼠模型诱导 3
2.2 p-ERK在PGF诱导黄体退化中的表达情况 4
3 讨论 5
3.1 PGF与黄体退化 5
3.2 ERK与黄体退化 5
4 结论 6
参考文献 6
假孕大鼠黄体退化过程中p-ERK1/2表达研究
动物科学 刘甜
引言
黄体是由格拉夫氏卵泡排卵之后形成的短暂的内分泌腺，在正常生殖周期和妊娠中起着重要作用。在动物没有受精或未妊娠时，黄体会发生退化进而溶解。黄体退化控制着生殖周期的长短，是生殖过程中的一个重要过程。黄体退化分为孕酮水平下降的功能性黄体退化和黄体细胞凋亡的结构性黄体退化两个阶段[1]。在众多哺乳动物中，尤其是家畜和啮齿类动物，前列腺素（PGF）被认为是主要的黄体溶剂[2-3]。使用PGF抗体，可以阻止黄体退化，用外源性PGF及其类似物会诱导多数哺乳动物的黄体退化[4]。
丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-a *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
ctivated protein kinases，MAPK）信号通路是一条广泛存在于各种动物细胞中的，将信号由细胞表面转导到细胞内部的信号转导途径，对于细胞周期的运行和基因的表达有调控作用[5]。目前，在哺乳动物中主要包含细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38转导通路。Greenberg小组[6]在1995年通过ERK、JNK和p38蛋白激酶对外界刺激反应的差异性和底物特异性的研究得出，ERK信号通路主要生理功能是促进细胞存活，而JNK和p38信号通路则是促进细胞凋亡。Rueda[7]等人实验显示，体外培养牛黄体细胞，紫外线照射后会导致p-JNK和p-p38的激活和p-ERK的减弱，说明细胞内MAPK信号通路在黄体功能和黄体退化有着重要作用。但是到目前为止，尚未发现鼠类动物在黄体退化初期MAPK成员的表达情况。
本研究以未成年雌性28日龄SD大鼠为研究对象，通过注射孕马血清促性腺激素（PMSG），48 h后注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）建立假孕大鼠模型（D0）。D7注射一定量的前列腺素类似物氯前列烯醇或生理盐水，分别在0min、10min、30min、1h、2h、4h处死大鼠，收集卵巢。一侧卵巢用多聚甲醛固定用于石蜡切片，观察卵巢的组织结构。另一侧卵巢-80℃冻存，采用Western Blot检测p-ERK1/2表达量。旨在研究PGF类似物氯前列烯醇诱导黄体退化过程中p-ERK1/2的变化规律，对深入了解PGF诱导黄体退化有着重要意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
健康21日龄雌性SD大鼠35只，清洁型，体重50g左右，购于南京栖霞利民科研动物养殖场。
1.1.2 试验器材
切片机、电热恒温水浴锅、通风橱、光学显微镜、电热恒温鼓风干燥箱、电子天平、载玻片（25．4×76．2mm，1mm～1．2mm）、盖玻片（18×18mm，0．13～0．17mm）、手术刀、手术剪、游标卡尺、镊子、广口瓶、烧杯、量筒、酒精灯、毛笔、磨刀石、试管架、染色架（30齿格）、定时器、切片盒（50片装）
1.1.3 试验试剂
PMSG、hCG（购宁波第二激素厂）、PGF（丹东绿丹和华动物药有限公司）、甲醛、无水乙醇、二甲苯、苏木精、中性树胶、生理盐水、石蜡
1.2 试验方法
1.2.1 取材与固定
将未成年雌性28日龄SD大鼠注射25 IU孕马血清促性腺激素（PMSG），48 h后注射25 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）建立假孕模型（D0）。D7注射一定量的前列腺素类似物氯前列烯醇或生理盐水（对照），分别在0min、10min、30min、1h、2h、4h处死大鼠，剖开腹部，切开卵巢囊，剪掉系膜和脂肪组织，收集卵巢。一侧卵巢置于-80℃冻存，用于Western Blot检测p-ERK表达。一侧卵巢用多聚甲醛固定，用HE染色，观察卵巢的组织结构。
1.2.2 样品处理
（1）脱水 70%乙醇1h→85%乙醇1h→95%乙醇1h→100%乙醇Ⅰ30min→100%乙醇Ⅱ30min→100%乙醇Ⅲ过夜
（2）透明 50%乙醇+50%二甲苯混合液 30min→二甲苯Ⅰ30min→二甲苯Ⅱ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
40min
（3）透蜡 50%二甲苯+50%石蜡混合液 30min→石蜡Ⅰ1h→石蜡Ⅱ真空过夜
（4）包埋 将预先融化好的石蜡注入金属框，待底面石蜡稍微凝固时，用温镊子夹取卵巢组织块放入金属框的中央，待稍凝，放入预备好的标签纸，然后将金属框快速全部浸入冰水中，待石蜡全部变硬后即取出，剥出蜡块。
（5）切片 将修好的蜡块进行切片，厚度为6 mm。切好的切片在38 ℃水浴锅中展片后用黏片剂处理的载玻片捞起。干热板38 ℃烤片6~8 h后，放于切片盒以备染色。
1.2.3 HE染色
（1）脱蜡 二甲苯Ⅰ7 min →二甲苯Ⅱ7 min
（2）水化 100%乙醇Ⅰ1 min →100%乙醇Ⅱ1 min →95%乙醇2 min →85%乙醇2 min →70%乙醇2 min →50%乙醇2 min →蒸馏水2 min
（3）苏木精染色 浸泡染色1 min
（4）颜色分化 自来水冲洗4 min ，蒸馏水6 min
（5）伊红染色 50%乙醇Ⅰ2 min →70%乙醇Ⅱ2 min →85%乙醇2 min →伊红染色2-5 sec
（6）洗涤 95%乙醇Ⅰ2 min →100%乙醇Ⅱ2 min
（7）脱水、透明 100%乙醇2 min →二甲苯Ⅰ4 min →二甲苯Ⅱ4 min
（8）树脂封片 光学显微镜（Nikon YS100）观察
1.2.4 Western Blot
（1）制胶 将玻璃板洗净，根据所要分析的蛋白质分子量大小配制分离胶，待分离胶聚合、凝固后，将浓缩胶溶液注入后立即插入梳子。
图1 假孕大鼠卵巢HE染色结果
A:假孕大鼠卵巢组织；B：假孕大鼠卵巢组织;C:假孕大鼠卵巢组织.图中箭头所示为黄体。
2.2 p-ERK在PGF诱导黄体退化中的表达情况
[10] Wiltbank MC，Guthrie PB，Mattson MP，Kater SB，Niswender GD．Hormonal regulation of free intracellular calcium concentrations in small and large ovine luteal cells[J]．Biol Reprod，1989，41（4）：771-778．
摘要：研究大鼠卵巢黄体退化过程中MAPK通路成员p-ERK1/2的变化规律，探讨其在PGF诱导黄体退化中的作用及机理。将未成年雌性28日龄SD大鼠注射25 IU孕马血清促性腺激素（PMSG），48 h后注射25 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）建立假孕模型（D0）。D7注射一定量的前列腺素类似物氯前列烯醇或生理盐水，分别在0min、10min、30min、1h、2h、4h处死大鼠，收集卵巢。一侧卵巢-80℃冻存，采用Western Blot检测p-ERK1/2表达量；另一侧卵巢用多聚甲醛固定用于石蜡切片，观察卵巢的组织结构。运用Western Blot技术检测发现p-ERK1/2在PGF类似物氯前列烯醇处理后10 min表达，至30min表达水平达到最高，然后60min时表达水平降低。p-ERK1/2在PGF诱导的大鼠黄体退化过程中可能具有一定作用。
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
关键字:黄体退化；PGF；p-ERK
目录
摘要 1
关键词 1
Abstract 1
Keywords 1
引言 1
1 材料与方法 2
1.1 试验材料 2
1.1.1 试验动物 2
1.1.2 试验器材 2
1.1.3 试验试剂 2
1.2 试验方法 2
1.2.1 取材与固定 2
1.2.2 样品处理 2
1.2.3 HE染色 2
1.2.4 Western Blot 3
1.2.5 统计方法 3
2 结果 3
2.1 假孕大鼠模型诱导 3
2.2 p-ERK在PGF诱导黄体退化中的表达情况 4
3 讨论 5
3.1 PGF与黄体退化 5
3.2 ERK与黄体退化 5
4 结论 6
参考文献 6
假孕大鼠黄体退化过程中p-ERK1/2表达研究
动物科学 刘甜
引言
黄体是由格拉夫氏卵泡排卵之后形成的短暂的内分泌腺，在正常生殖周期和妊娠中起着重要作用。在动物没有受精或未妊娠时，黄体会发生退化进而溶解。黄体退化控制着生殖周期的长短，是生殖过程中的一个重要过程。黄体退化分为孕酮水平下降的功能性黄体退化和黄体细胞凋亡的结构性黄体退化两个阶段[1]。在众多哺乳动物中，尤其是家畜和啮齿类动物，前列腺素（PGF）被认为是主要的黄体溶剂[2-3]。使用PGF抗体，可以阻止黄体退化，用外源性PGF及其类似物会诱导多数哺乳动物的黄体退化[4]。
丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-a *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
ctivated protein kinases，MAPK）信号通路是一条广泛存在于各种动物细胞中的，将信号由细胞表面转导到细胞内部的信号转导途径，对于细胞周期的运行和基因的表达有调控作用[5]。目前，在哺乳动物中主要包含细胞外调节蛋白激酶（ERK）、c-Jun氨基末端激酶（JNK）、p38转导通路。Greenberg小组[6]在1995年通过ERK、JNK和p38蛋白激酶对外界刺激反应的差异性和底物特异性的研究得出，ERK信号通路主要生理功能是促进细胞存活，而JNK和p38信号通路则是促进细胞凋亡。Rueda[7]等人实验显示，体外培养牛黄体细胞，紫外线照射后会导致p-JNK和p-p38的激活和p-ERK的减弱，说明细胞内MAPK信号通路在黄体功能和黄体退化有着重要作用。但是到目前为止，尚未发现鼠类动物在黄体退化初期MAPK成员的表达情况。
本研究以未成年雌性28日龄SD大鼠为研究对象，通过注射孕马血清促性腺激素（PMSG），48 h后注射人绒毛膜促性腺激素（hCG）建立假孕大鼠模型（D0）。D7注射一定量的前列腺素类似物氯前列烯醇或生理盐水，分别在0min、10min、30min、1h、2h、4h处死大鼠，收集卵巢。一侧卵巢用多聚甲醛固定用于石蜡切片，观察卵巢的组织结构。另一侧卵巢-80℃冻存，采用Western Blot检测p-ERK1/2表达量。旨在研究PGF类似物氯前列烯醇诱导黄体退化过程中p-ERK1/2的变化规律，对深入了解PGF诱导黄体退化有着重要意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验动物
健康21日龄雌性SD大鼠35只，清洁型，体重50g左右，购于南京栖霞利民科研动物养殖场。
1.1.2 试验器材
切片机、电热恒温水浴锅、通风橱、光学显微镜、电热恒温鼓风干燥箱、电子天平、载玻片（25．4×76．2mm，1mm～1．2mm）、盖玻片（18×18mm，0．13～0．17mm）、手术刀、手术剪、游标卡尺、镊子、广口瓶、烧杯、量筒、酒精灯、毛笔、磨刀石、试管架、染色架（30齿格）、定时器、切片盒（50片装）
1.1.3 试验试剂
PMSG、hCG（购宁波第二激素厂）、PGF（丹东绿丹和华动物药有限公司）、甲醛、无水乙醇、二甲苯、苏木精、中性树胶、生理盐水、石蜡
1.2 试验方法
1.2.1 取材与固定
将未成年雌性28日龄SD大鼠注射25 IU孕马血清促性腺激素（PMSG），48 h后注射25 IU人绒毛膜促性腺激素（hCG）建立假孕模型（D0）。D7注射一定量的前列腺素类似物氯前列烯醇或生理盐水（对照），分别在0min、10min、30min、1h、2h、4h处死大鼠，剖开腹部，切开卵巢囊，剪掉系膜和脂肪组织，收集卵巢。一侧卵巢置于-80℃冻存，用于Western Blot检测p-ERK表达。一侧卵巢用多聚甲醛固定，用HE染色，观察卵巢的组织结构。
1.2.2 样品处理
（1）脱水 70%乙醇1h→85%乙醇1h→95%乙醇1h→100%乙醇Ⅰ30min→100%乙醇Ⅱ30min→100%乙醇Ⅲ过夜
（2）透明 50%乙醇+50%二甲苯混合液 30min→二甲苯Ⅰ30min→二甲苯Ⅱ *好棒文|www.hbsrm.com +Q: 3_5_1_9_1_6_0_7_2
40min
（3）透蜡 50%二甲苯+50%石蜡混合液 30min→石蜡Ⅰ1h→石蜡Ⅱ真空过夜
（4）包埋 将预先融化好的石蜡注入金属框，待底面石蜡稍微凝固时，用温镊子夹取卵巢组织块放入金属框的中央，待稍凝，放入预备好的标签纸，然后将金属框快速全部浸入冰水中，待石蜡全部变硬后即取出，剥出蜡块。
（5）切片 将修好的蜡块进行切片，厚度为6 mm。切好的切片在38 ℃水浴锅中展片后用黏片剂处理的载玻片捞起。干热板38 ℃烤片6~8 h后，放于切片盒以备染色。
1.2.3 HE染色
（1）脱蜡 二甲苯Ⅰ7 min →二甲苯Ⅱ7 min
（2）水化 100%乙醇Ⅰ1 min →100%乙醇Ⅱ1 min →95%乙醇2 min →85%乙醇2 min →70%乙醇2 min →50%乙醇2 min →蒸馏水2 min
（3）苏木精染色 浸泡染色1 min
（4）颜色分化 自来水冲洗4 min ，蒸馏水6 min
（5）伊红染色 50%乙醇Ⅰ2 min →70%乙醇Ⅱ2 min →85%乙醇2 min →伊红染色2-5 sec
（6）洗涤 95%乙醇Ⅰ2 min →100%乙醇Ⅱ2 min
（7）脱水、透明 100%乙醇2 min →二甲苯Ⅰ4 min →二甲苯Ⅱ4 min
（8）树脂封片 光学显微镜（Nikon YS100）观察
1.2.4 Western Blot
（1）制胶 将玻璃板洗净，根据所要分析的蛋白质分子量大小配制分离胶，待分离胶聚合、凝固后，将浓缩胶溶液注入后立即插入梳子。
图1 假孕大鼠卵巢HE染色结果
A:假孕大鼠卵巢组织；B：假孕大鼠卵巢组织;C:假孕大鼠卵巢组织.图中箭头所示为黄体。
2.2 p-ERK在PGF诱导黄体退化中的表达情况
[10] Wiltbank MC，Guthrie PB，Mattson MP，Kater SB，Niswender GD．Hormonal regulation of free intracellular calcium concentrations in small and large ovine luteal cells[J]．Biol Reprod，1989，41（4）：771-778．
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/1049.html
