猪肺炎支原体的表面蛋白烯醇化酶的表达及酶活性分析
猪支原体肺炎（Mycoplasmal Pneumonia of Swine，MPS），又常称为猪地方性流行性肺炎（Swine Enzootic Pneumonia，SEP），是由猪肺炎支原体（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）引起的慢性接触性传染病，是猪呼吸道病综合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）的主要原发性病原之一，虽然发病率高，死亡率较低，但是由于Mhp能破坏呼吸道黏膜—纤毛屏障，从而导致继发感染。在全球养猪业，猪肺炎支原体的感染情况很普遍,感染率在40%至100%，使养猪业遭受严重的经济损失。在各种支原体的感染与致病中，毒力相关因子一直扮演着非常重要的角色。但是现阶段对Mhp的毒力相关因子的研究了解还很少，仅仅证实了Mhp编码的部分黏附蛋白和酶类与毒力相关，仍难以解释Mhp复杂的免疫与致病机制。烯醇化酶（Enolase）在细胞质内参与糖酵解过程，其有α、β、γ三种同分异构体，其中α-Enolase主要存在于某些支原体和细菌的表面，参与某些致病过程。本试验通过对Mhp的表面蛋白烯醇化酶进行研究，为猪肺炎支原体致病机理以及以此为基础的早期诊断、疫苗和药物研究提供参考资料。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料、试剂与仪器2
1.1 质粒与菌株 2
1.2 主要材料与试剂 2
1.3 试验仪器2
2 方法2
2.1 试剂配制2
2.1.1 金属离子母液的配制2
2.1.2 其他试剂的配制2
2.1.3 HEPES缓冲液的配制2
2.2 引物的设计与合成3
2.3 Mhp Eno基因的PCR扩增3
2.3.1 获得产物Mhp Eno13
2.3.2获得产物Mhp Eno23
2.3.3获得产物Mhp Eno4
2.3.4 Mhp Eno基因的回收纯化4
2.4 Mhp Eno基因与pMD18T载体的连接5
2.5 重组质粒DNA的提取 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
、鉴定及测序5
2.5.1 重组质粒的提取5
2.5.2 重组质粒的PCR鉴定5
2.5.3 重组质粒的酶切鉴定5
2.5.4 重组质粒的测序鉴定5
2.6 pGEX4T1/Mhp Eno表达载体的构建5
2.6.1 pMD18T/Eno、pGEX4T1载体的酶切及酶切片段的连接6
2.6.2 连接产物的转化、重组质粒DNA的提取及鉴定6
2.7重组质粒的诱导表达及SDSPAGE检测6
2.7.1 重组质粒的诱导表达6
2.7.2 表达产物的SDSPAGE检测7
2.7.3 WB鉴定7
2.7.4 表达量分析及表达形式分析7
2.8 重组蛋白的纯化7
2.9 烯醇化酶酶活性分析7
2.9.1 酶活性原理7
2.9.2 操作步骤7
3 结果与分析7
3.1 猪肺炎支原体Eno基因的扩增7
3.2 重组质粒的PCR鉴定8
3.3 Mhp Eno测序比较9
3.4 酶活性分析9
4 讨论9
致谢10
参考文献10
猪肺炎支原体烯醇化酶的表达及酶活性分析
引言
猪支原体肺炎(MPS)是猪的一种高发病率、低死亡率的慢性呼吸道传染病，由猪肺炎支原体（Mhp）引起，在我国常被称为猪喘气病（或气喘病）。1965年，在美国（Mare和Switzer）和英国几乎同时从病畜中分离出Mhp。从那时起，Mhp在诱导猪慢性肺炎中的作用一直是养猪业尚未解决的问题[1]。MPS的主要特征是气喘和咳嗽，影响猪的生长发育。病猪长期生长发育不良，降低了生长率和饲料转化率，一般死亡率不高，但引起的继发性感染也会造成严重死亡，给猪场带来巨大的经济损失，对养猪业发展造成严重危害[2]。Mhp具有复杂的致病机理，感染时Mhp首先识别呼吸道粘膜纤毛受体，与其特异性结合后再生长、繁殖。同时，它还可以分泌一种具有黏附功能的丝状蛋白，协助其在猪呼吸道外的支气管和细支气管纤毛顶端黏附；同时释放分裂素、黏附素、蛋白酶及其他代谢中间产物，进一步破坏呼吸道黏膜层，使纤毛蠕动减弱、萎缩、脱落、诱发咳嗽。随即Mhp移居他处，进入呼吸道的异物及气管黏膜产生的分泌物，因为纤毛的损伤而无法排除，最终在支气管末端和肺泡中沉降，逐渐形成胰样变，咳嗽和气喘加剧，最终破坏肺脏功能。
1934年，Lohman和Mayerhof在研究肌肉提取物时，在磷酸甘油酸转换为丙酮酸的过程中发现的烯醇化酶[3]，又称D2磷酸甘油盐水解酶，是糖酵解过程所必须的胞内酶，能催化2磷酸烯醇式丙酮酸盐，同时也在糖异生过程中催化逆向反应[4]。烯醇化酶在真核和原核生物细胞中普遍存在，其在细菌中的含量丰富，且具有高度保守性[56]。它不但在糖代谢中发挥重要作用，还是细菌中的一种毒素，并能够结合血纤溶酶原或纤连蛋白，参与病原的黏附和致病过程[69]。
本研究对猪支原体肺炎的烯醇化酶进行了研究，依据Mhp Eno基因设计引物，扩增后将该片段克隆到pGEX4T1表达载体，以期实现Mhp Eno基因在大肠杆菌表达系统中高效表达，并设计试验方法检测其活性。
1 材料、试剂与仪器
1．1 质粒与菌株
猪肺炎支原体168株F341的全基因组DNA、表达载体pGEX4T1由江苏省农业科学院兽医研究所保存；大肠杆菌Trans5α、BL21(DE3)感受态细胞购自Vazyme公司；pMD18T Vector Kit购自TaKaRa公司。
1．2 主要材料与试剂
PCR各种试剂、体系中Mix购自Vazyme公司；DNA Marker购自Vazyme公司； T4 DNA连接酶、DNA和蛋白质分子量标准、Ecol I和Xho I限制性内切酶均购自大连TaKaRa公司；兔肌肉烯醇化酶、D（+）2磷酸甘油酸（2PGA）购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。
1．3 试验仪器
离心机、PCR扩增仪、自动凝胶图像分析仪、稳压稳流电泳仪、电泳槽、全波长酶标仪、水浴锅、电子天平、培养箱等。
2 方法
2．1 试剂配制
2.1.1 金属离子母液的配制 分别称取不同质量的MgCl26H2O、ZnCl2、MnCl2、AlCl3、NiSO4、BaCl2和 LiCl，加入10 mL去离子水使充分溶解备用，并使终浓度均为100 mmol/L[11]。
2.1.2 其他试剂的配制
（1）Hepes原液：称取2.383 g Hepes溶解于10 mL超纯水中，使反应终浓度为1 mol/L，室温保存。
（2）2PGA原液：称取0.025 g 2PGA溶解于100 μL超纯水中，使终浓度为1 mol/L，10 μL/支分装，—40℃保存。
2.1.3 Hepes缓冲液的配制 称取0.0574 g KCl 放入corning管中，加入1 mL Hepes原液(1 mol/L)，再加入1 mL MgCl2母液(0.1 mol/L)，再加入适当体积的去离子水，加入不同浓度的NaOH或 HCl，利用pH计准确调整缓冲液的pH为7.5，定容后放置于4℃冰箱中备用（注意缓冲液最好是现配现用，避免长时间的放置，以免影响研究结果的准确性）[10]。并以相同浓度的ZnCl2（只有它是促进酶活性的）替代缓冲液中的MgCl2，并配置缓冲液。
2．2 引物的设计与合成
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1 材料、试剂与仪器2
1.1 质粒与菌株 2
1.2 主要材料与试剂 2
1.3 试验仪器2
2 方法2
2.1 试剂配制2
2.1.1 金属离子母液的配制2
2.1.2 其他试剂的配制2
2.1.3 HEPES缓冲液的配制2
2.2 引物的设计与合成3
2.3 Mhp Eno基因的PCR扩增3
2.3.1 获得产物Mhp Eno13
2.3.2获得产物Mhp Eno23
2.3.3获得产物Mhp Eno4
2.3.4 Mhp Eno基因的回收纯化4
2.4 Mhp Eno基因与pMD18T载体的连接5
2.5 重组质粒DNA的提取 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
、鉴定及测序5
2.5.1 重组质粒的提取5
2.5.2 重组质粒的PCR鉴定5
2.5.3 重组质粒的酶切鉴定5
2.5.4 重组质粒的测序鉴定5
2.6 pGEX4T1/Mhp Eno表达载体的构建5
2.6.1 pMD18T/Eno、pGEX4T1载体的酶切及酶切片段的连接6
2.6.2 连接产物的转化、重组质粒DNA的提取及鉴定6
2.7重组质粒的诱导表达及SDSPAGE检测6
2.7.1 重组质粒的诱导表达6
2.7.2 表达产物的SDSPAGE检测7
2.7.3 WB鉴定7
2.7.4 表达量分析及表达形式分析7
2.8 重组蛋白的纯化7
2.9 烯醇化酶酶活性分析7
2.9.1 酶活性原理7
2.9.2 操作步骤7
3 结果与分析7
3.1 猪肺炎支原体Eno基因的扩增7
3.2 重组质粒的PCR鉴定8
3.3 Mhp Eno测序比较9
3.4 酶活性分析9
4 讨论9
致谢10
参考文献10
猪肺炎支原体烯醇化酶的表达及酶活性分析
引言
猪支原体肺炎(MPS)是猪的一种高发病率、低死亡率的慢性呼吸道传染病，由猪肺炎支原体（Mhp）引起，在我国常被称为猪喘气病（或气喘病）。1965年，在美国（Mare和Switzer）和英国几乎同时从病畜中分离出Mhp。从那时起，Mhp在诱导猪慢性肺炎中的作用一直是养猪业尚未解决的问题[1]。MPS的主要特征是气喘和咳嗽，影响猪的生长发育。病猪长期生长发育不良，降低了生长率和饲料转化率，一般死亡率不高，但引起的继发性感染也会造成严重死亡，给猪场带来巨大的经济损失，对养猪业发展造成严重危害[2]。Mhp具有复杂的致病机理，感染时Mhp首先识别呼吸道粘膜纤毛受体，与其特异性结合后再生长、繁殖。同时，它还可以分泌一种具有黏附功能的丝状蛋白，协助其在猪呼吸道外的支气管和细支气管纤毛顶端黏附；同时释放分裂素、黏附素、蛋白酶及其他代谢中间产物，进一步破坏呼吸道黏膜层，使纤毛蠕动减弱、萎缩、脱落、诱发咳嗽。随即Mhp移居他处，进入呼吸道的异物及气管黏膜产生的分泌物，因为纤毛的损伤而无法排除，最终在支气管末端和肺泡中沉降，逐渐形成胰样变，咳嗽和气喘加剧，最终破坏肺脏功能。
1934年，Lohman和Mayerhof在研究肌肉提取物时，在磷酸甘油酸转换为丙酮酸的过程中发现的烯醇化酶[3]，又称D2磷酸甘油盐水解酶，是糖酵解过程所必须的胞内酶，能催化2磷酸烯醇式丙酮酸盐，同时也在糖异生过程中催化逆向反应[4]。烯醇化酶在真核和原核生物细胞中普遍存在，其在细菌中的含量丰富，且具有高度保守性[56]。它不但在糖代谢中发挥重要作用，还是细菌中的一种毒素，并能够结合血纤溶酶原或纤连蛋白，参与病原的黏附和致病过程[69]。
本研究对猪支原体肺炎的烯醇化酶进行了研究，依据Mhp Eno基因设计引物，扩增后将该片段克隆到pGEX4T1表达载体，以期实现Mhp Eno基因在大肠杆菌表达系统中高效表达，并设计试验方法检测其活性。
1 材料、试剂与仪器
1．1 质粒与菌株
猪肺炎支原体168株F341的全基因组DNA、表达载体pGEX4T1由江苏省农业科学院兽医研究所保存；大肠杆菌Trans5α、BL21(DE3)感受态细胞购自Vazyme公司；pMD18T Vector Kit购自TaKaRa公司。
1．2 主要材料与试剂
PCR各种试剂、体系中Mix购自Vazyme公司；DNA Marker购自Vazyme公司； T4 DNA连接酶、DNA和蛋白质分子量标准、Ecol I和Xho I限制性内切酶均购自大连TaKaRa公司；兔肌肉烯醇化酶、D（+）2磷酸甘油酸（2PGA）购自Sigma公司；其他试剂均为国产分析纯。
1．3 试验仪器
离心机、PCR扩增仪、自动凝胶图像分析仪、稳压稳流电泳仪、电泳槽、全波长酶标仪、水浴锅、电子天平、培养箱等。
2 方法
2．1 试剂配制
2.1.1 金属离子母液的配制 分别称取不同质量的MgCl26H2O、ZnCl2、MnCl2、AlCl3、NiSO4、BaCl2和 LiCl，加入10 mL去离子水使充分溶解备用，并使终浓度均为100 mmol/L[11]。
2.1.2 其他试剂的配制
（1）Hepes原液：称取2.383 g Hepes溶解于10 mL超纯水中，使反应终浓度为1 mol/L，室温保存。
（2）2PGA原液：称取0.025 g 2PGA溶解于100 μL超纯水中，使终浓度为1 mol/L，10 μL/支分装，—40℃保存。
2.1.3 Hepes缓冲液的配制 称取0.0574 g KCl 放入corning管中，加入1 mL Hepes原液(1 mol/L)，再加入1 mL MgCl2母液(0.1 mol/L)，再加入适当体积的去离子水，加入不同浓度的NaOH或 HCl，利用pH计准确调整缓冲液的pH为7.5，定容后放置于4℃冰箱中备用（注意缓冲液最好是现配现用，避免长时间的放置，以免影响研究结果的准确性）[10]。并以相同浓度的ZnCl2（只有它是促进酶活性的）替代缓冲液中的MgCl2，并配置缓冲液。
2．2 引物的设计与合成
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