应用实时荧光rtpcr技术检测pedv
猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）属于冠状病毒科、冠状病毒属，主要引起各年龄猪水样腹泻和新生仔猪脱水致死等症状。本研究应用实时荧光定量RT-PCR技术对2015年3月至5月期间送检至江苏省出入境检验检疫局动检实验室要求检测PEDV的样品（共计124份）进行病原检测，对检测结果为阴性和阳性的数量分别统计，并结合阳性病例的特征症状以及对阳性样品进一步进行测序鉴定以确认感染。经统计，样品阳性率为3.2%，阴性率为96.8%。阳性病例的共同表现为食欲减退、形体消瘦、精神沉郁。水样腹泻及高度致死性体现在4日龄内阳性仔猪身上。实时荧光定量RT-PCR技术是一项简单、准确、具有高灵敏度及低污染性的新兴技术，在PEDV的分子生物学诊断方面发挥重要作用。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1引言 1
1 材料与方法2
1.1 病料样品 2
1.2 试剂 2
1.3 仪器和设备2
1.4 样品处理2
1.5 RNA提取2
1.6 荧光定量RTPCR检测2
2.实验结果 3
2.1 质控标准3
2.2 结果分析判定3
2.3 单次阴性样品的荧光定量RTPCR扩增结果3
2.4 单次阳性样品的荧光定量RTPCR扩增结果3
2.5阳性样品的基因测序鉴定结果4
2.6要求检测PEDV的送检样品数量的时间分布5
2.7要求检测PEDV的送检样品数量的来源分布5
2.8 要求检测PEDV的送检样品的阳性率5
2.9 阳性病例的特征症状比较5
3 讨论6
致谢8
参考文献8
应用实时荧光RTPCR技术检测PEDV
引言
猪流行性腹泻（PED）是由PED病毒（PEDV）引起的一种以呕吐、水样腹泻和食欲下降为特征的高度接触性肠道传染病。该病毒通过粪口传播。各年龄猪均易感且尤以冬季发病严重[1]。PED在欧洲首次发生，却在亚洲成为严重的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
传染病。该病死亡率虽较猪传染性胃肠炎（TGE）低，但因腹泻会影响猪只增重，且有试验显示断奶后的猪在猪场PED爆发后的710天内不会增重，这将导致育肥猪上市时间延迟12周，使养猪业生产蒙受重大损失。1971年英国首次报道PED，比利时的Pensaert于1977年首次从病料中分离到一株PEDV，并将之命名为类冠状病毒CV777，1988年，Hofmann等首次在含胰酶的Vero细胞上成功复制出PEDV。
当前检测该病毒的常规方法有采用细胞分离病毒，血清中和试验，ELISA以及荧光定量PCR技术[2]，但前三种方法在灵敏度、时间以及成本上存在问题，不具有荧光定量PCR检测方法的高灵敏度、强特异性以及时效性等优点。因此本研究选取采用荧光定量PCR技术对疑似感染PEDV的送检病料进行检测以确诊该病，从而帮助阻止病毒传播、减少经济损失。
1 材料与方法
1．1 病料样品
于2015年3月至2015年5月，送检至江苏省出入境检验检疫局动检实验室并要求检测PEDV的病料样品共124份。其中78份粪便样品，40份棉拭子,6份病死仔猪小肠组织。
1．2 试剂
RNA裂解液（凯杰生物工程有限公司）；荧光RTPCR反应液、酶混合物、PEDV阳性质控品、阴性质控品、DEPC水（均来自北京森康生物技术开发有限公司）。
1.3 仪器和设备
匀浆机PT6100购自PPLYTRON公司；Authorized Thermal Cycle PCR仪购自Eppendorf公司；高速离心机购自Thermo公司。
1.4 样品处理
根据不同的样品，处理方法具体如下：①小肠组织：取少许小肠段置于匀浆袋中，加入少量生理盐水，匀浆10min制成组织匀浆液，反复冻融3次，12000r/min离心5min，取上清置于80℃冻存。②粪便：用少量生理盐水稀释混匀粪便，反复冻融3次，12000r/min离心5min，取上清置于80℃冻存。③棉拭子：用少量生理盐水稀释混匀后，吸取足够样液置于80℃冻存。若送检单要求5混一处理，则还需对上述处理后的样品进行混样，即单件样品吸取40μl，每五件样品置于一只EP管，则每只EP管内共200μl样液。
1.5 RNA的提取
按如下步骤提取RNA：取200μl样液加入600μlRNA裂解液，混匀静置2min；加入200μl氯仿，震荡，4℃下12000r/min离心15分钟；取上清，加入0.8倍体积异丙醇，震荡，4℃下12000r/min离心10分钟；弃上清，加入75%乙醇500μl，洗涤沉淀，4℃下12000r/min离心5分钟；弃乙醇，控干后加入30μl水，弹散后速离，置于80℃冻存。
1.6 荧光定量RTPCR检测
荧光定量PCR扩增步骤如下：取出荧光RTPCR反应液，酶混合物，室温融化后，2000r/min离心5s；每个测试反应体系需要15μl荧光RTPCR反应液和1μl酶混合物；根据PCR反应管数目=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混合均匀后，向每个PCR管中各分装15μl；每管再加入10μlRNA溶液，盖紧管盖，500r/min离心30s；将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，作好标记。
反应参数设置：
第一步反转录42℃（30min）；
第二步预变性92℃（3min）；
第三步94℃（15s）,52℃（10s）,60 ℃（35s）共40个循环，最后40℃（2min）。荧光收集发生在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。
取8μlPCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收PCR产物克隆于pMD18T载体中由金斯瑞技术支持中心进行测序鉴定。
2 实验结果
2.1 质控标准
阴性对照无Ct值且无扩增曲线；阳性对照的Ct值小于等于28且出现典型的扩增曲线。若阴性和阳性对照不满足上述条件，此次实验视为无效。
2.2 结果分析判定
无Ct值,且无特征性扩增曲线，即样品为阴性；Ct值小于等于30，且出现典型的扩增曲线，即样品为阳性；Ct值大于30，且出现典型的扩增曲线的样品建议复检。复检仍出现上述结果的，判为阳性，否则为阴性。
2.3 单次阴性样品的荧光定量RTPCR扩增结果
于2015年4月24日送检的样品为取自17周龄猪的粪便，共计20份，每5份混成一份后检测，用Lightcycler Software Version3.5软件进行分析，结果如图1所示。图示阴性对照无Ct值且无扩增曲线，阳性对照的Ct值明显小于28，范围在26至28的区间，且出现明显扩增曲线，故本次实验结果有效。图示中4份样品实验结果均为阴性。
图1 阴性样品扩增曲线
①：阳性对照；②：阴性对照
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1引言 1
1 材料与方法2
1.1 病料样品 2
1.2 试剂 2
1.3 仪器和设备2
1.4 样品处理2
1.5 RNA提取2
1.6 荧光定量RTPCR检测2
2.实验结果 3
2.1 质控标准3
2.2 结果分析判定3
2.3 单次阴性样品的荧光定量RTPCR扩增结果3
2.4 单次阳性样品的荧光定量RTPCR扩增结果3
2.5阳性样品的基因测序鉴定结果4
2.6要求检测PEDV的送检样品数量的时间分布5
2.7要求检测PEDV的送检样品数量的来源分布5
2.8 要求检测PEDV的送检样品的阳性率5
2.9 阳性病例的特征症状比较5
3 讨论6
致谢8
参考文献8
应用实时荧光RTPCR技术检测PEDV
引言
猪流行性腹泻（PED）是由PED病毒（PEDV）引起的一种以呕吐、水样腹泻和食欲下降为特征的高度接触性肠道传染病。该病毒通过粪口传播。各年龄猪均易感且尤以冬季发病严重[1]。PED在欧洲首次发生，却在亚洲成为严重的 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
传染病。该病死亡率虽较猪传染性胃肠炎（TGE）低，但因腹泻会影响猪只增重，且有试验显示断奶后的猪在猪场PED爆发后的710天内不会增重，这将导致育肥猪上市时间延迟12周，使养猪业生产蒙受重大损失。1971年英国首次报道PED，比利时的Pensaert于1977年首次从病料中分离到一株PEDV，并将之命名为类冠状病毒CV777，1988年，Hofmann等首次在含胰酶的Vero细胞上成功复制出PEDV。
当前检测该病毒的常规方法有采用细胞分离病毒，血清中和试验，ELISA以及荧光定量PCR技术[2]，但前三种方法在灵敏度、时间以及成本上存在问题，不具有荧光定量PCR检测方法的高灵敏度、强特异性以及时效性等优点。因此本研究选取采用荧光定量PCR技术对疑似感染PEDV的送检病料进行检测以确诊该病，从而帮助阻止病毒传播、减少经济损失。
1 材料与方法
1．1 病料样品
于2015年3月至2015年5月，送检至江苏省出入境检验检疫局动检实验室并要求检测PEDV的病料样品共124份。其中78份粪便样品，40份棉拭子,6份病死仔猪小肠组织。
1．2 试剂
RNA裂解液（凯杰生物工程有限公司）；荧光RTPCR反应液、酶混合物、PEDV阳性质控品、阴性质控品、DEPC水（均来自北京森康生物技术开发有限公司）。
1.3 仪器和设备
匀浆机PT6100购自PPLYTRON公司；Authorized Thermal Cycle PCR仪购自Eppendorf公司；高速离心机购自Thermo公司。
1.4 样品处理
根据不同的样品，处理方法具体如下：①小肠组织：取少许小肠段置于匀浆袋中，加入少量生理盐水，匀浆10min制成组织匀浆液，反复冻融3次，12000r/min离心5min，取上清置于80℃冻存。②粪便：用少量生理盐水稀释混匀粪便，反复冻融3次，12000r/min离心5min，取上清置于80℃冻存。③棉拭子：用少量生理盐水稀释混匀后，吸取足够样液置于80℃冻存。若送检单要求5混一处理，则还需对上述处理后的样品进行混样，即单件样品吸取40μl，每五件样品置于一只EP管，则每只EP管内共200μl样液。
1.5 RNA的提取
按如下步骤提取RNA：取200μl样液加入600μlRNA裂解液，混匀静置2min；加入200μl氯仿，震荡，4℃下12000r/min离心15分钟；取上清，加入0.8倍体积异丙醇，震荡，4℃下12000r/min离心10分钟；弃上清，加入75%乙醇500μl，洗涤沉淀，4℃下12000r/min离心5分钟；弃乙醇，控干后加入30μl水，弹散后速离，置于80℃冻存。
1.6 荧光定量RTPCR检测
荧光定量PCR扩增步骤如下：取出荧光RTPCR反应液，酶混合物，室温融化后，2000r/min离心5s；每个测试反应体系需要15μl荧光RTPCR反应液和1μl酶混合物；根据PCR反应管数目=样本数+1管阳性对照+1管阴性对照，计算好各试剂的使用量，加入一适当体积小管中，充分混合均匀后，向每个PCR管中各分装15μl；每管再加入10μlRNA溶液，盖紧管盖，500r/min离心30s；将加样后的PCR管放入荧光PCR检测仪内，作好标记。
反应参数设置：
第一步反转录42℃（30min）；
第二步预变性92℃（3min）；
第三步94℃（15s）,52℃（10s）,60 ℃（35s）共40个循环，最后40℃（2min）。荧光收集发生在第三阶段每次循环的60℃延伸时进行。
取8μlPCR产物经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。胶回收PCR产物克隆于pMD18T载体中由金斯瑞技术支持中心进行测序鉴定。
2 实验结果
2.1 质控标准
阴性对照无Ct值且无扩增曲线；阳性对照的Ct值小于等于28且出现典型的扩增曲线。若阴性和阳性对照不满足上述条件，此次实验视为无效。
2.2 结果分析判定
无Ct值,且无特征性扩增曲线，即样品为阴性；Ct值小于等于30，且出现典型的扩增曲线，即样品为阳性；Ct值大于30，且出现典型的扩增曲线的样品建议复检。复检仍出现上述结果的，判为阳性，否则为阴性。
2.3 单次阴性样品的荧光定量RTPCR扩增结果
于2015年4月24日送检的样品为取自17周龄猪的粪便，共计20份，每5份混成一份后检测，用Lightcycler Software Version3.5软件进行分析，结果如图1所示。图示阴性对照无Ct值且无扩增曲线，阳性对照的Ct值明显小于28，范围在26至28的区间，且出现明显扩增曲线，故本次实验结果有效。图示中4份样品实验结果均为阴性。
图1 阴性样品扩增曲线
①：阳性对照；②：阴性对照
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