脂质体介导法体外转染鸡胚盘干细胞的研究
转基因动物的安全性日益受到关注，采用去除抗性基因的线性化质粒转染转基因动物是提高其安全性的一种方法。本实验采用脂质体转染的方法，分别用单酶切、缺失抗性基因的EGFP-N1质粒，只保留功能结构的双顺反子基因转移体CMV-EGFP-polyA和完整的EGFP-N1质粒体外转染鸡胚盘干细胞，对比分析三者的转染效率，探讨利用线性化质粒制备转基因鸡的可行性。结果表明线性化的EGFP-N1质粒仍能行使基因转移，表达等功能，但转染效率较低。这为家禽构建安全的转基因载体提供的新的思路。
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1试验材料3
1.1.1 试验动物、菌株及质粒3
1.1.2 试验试剂 3
1.1.3 细胞培养用品 3
1.1.4 主要仪器设备 4
1.1.5 主要溶液配置 4
1.1.6 分析软件 5
1.2 实验方法 5
1.2.1 质粒的制备与线性化 5
1.2.2 回收目的DNA片段 8
1.2.3 cEXC由X期胚盘组织中体外分离 8
1.2.4 脂质体法转染9
1.2.5 细胞染色统计死亡率9
结果与分析 9
2.1 质粒的线性化10
2.2 转染结果11
2.3 细胞死亡率11
3 讨论 11
致谢13
参考文献14
脂质体介导法体外转染鸡胚干细胞的研究
引言
动物转基因技术是一种通过基因工程技术将外源基因整合到受体动物基因组中从而使其得以表达和遗传的生物技术，最早出现于20世纪70年代中期。随着转基因新技术的出现，转基因动物的制备效率大大提高，使得转基因表达的精确调控得以实现，从而使转基因动物的研究取得了飞速发展，甚至已经进入了产业化的应用阶段。随着转基因植物和转基因动物产品进入产业应用，转基因生物的安全性受到越来越多的关注。在转基因研究中，通常都使用完整重组 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
质粒进行直接转染。这样的载体骨架序列、抗性基因、标记基因的随机整合及遗传会成为不安全因素，令人担忧。载体骨架序列也会整合进染色体中[14]，确有研究证明载体骨架序列的整合会带来许多安全隐患。Muller等[5]认为载体骨架序列含有回文结构，这些回文结构能够使质粒与质粒之间形成稳定的二级结构，促进异常重组。Philip等[6]认为，当载体骨架序列被转录成RNA时，这些RNA就很可能干扰目的基因RNA的合成及加工，且载体骨架序列很可能与转基因的多拷贝有关。Stoger等[7]认为外源载体序列和目的基因序列一起整合会带来非常大的转基因位点，而大的转基因位点在立体结构上非常不稳定，易导致在转基因后代中位点的丢失和表达的沉默。如何避免抗性基因、标记基因带来的安全隐患己成为转基因研究的热点。目前，研究者多采用Cre/Loxp系统、FLP/FRT系统或RRS系统等途径将这些不利基因删除[8,9]。虽然采用Cre/Loxp重组酶系统可以将抗性基因或标志基因等去除，但该方法需要二次转染且技术繁杂[10]。在转基因植物中，将只含有转基因表达所需的基本元件(启动子、开放阅读框和终止子)而不含有载体骨架序列和选择性标记的线形DNA，相对于完整的重组质粒，用这种基因表达盒独立转移体直接转化不会降低转化率，而且外源基因的整合与稳定遗传也不会受到影响[11]，还有助于实现比较好的共表达[12,13]。这种方法在转基因水稻[14]、小麦[15]、葡萄[16]及甜瓜[17]中均获得成功。但是，基因表达盒直接转化是否能够使外源基因以较低拷贝数的简单方式直接整合，仍存在着一定的争议。利用这种技术进行动物方面的转基因研究也开始有所报道[18]。
转基因家禽有非常广泛的应用前景，但其应用价值还有赖于确立实用、可行的转基因制备方案。选择家禽作为转基因研究动物是因为其有两大优点，一是由于相对于哺乳动物，家禽胚胎较容易获得，操作方便。二是其能够产生有价值蛋白，是一种高效生物反应器。各种各样的方法已被尝试用于转基因鸡的制备，比如脂质体法、电转染法、慢病毒转染法等。尽管病毒转染法的转染效率较高，但其对胚胎具有一定的危险性。脂质体是由生物可降解组成，具有操作简便、毒性小、转染效率高、对基因无限制、又没有病毒作载体引发生物癌变或变异的可能[19]，且脂质载体的免疫原性通常较低[20]。
经过分析各方法优缺点，本实验拟采用脂质体转染的方法探讨制备转基因鸡的可行性，分别用单酶切、缺失抗性基因的pEGFPN1质粒，双顺反子基因转移体CMVEGFPpolyA和完整的pEGFPN1质粒体外转染鸡胚盘干细胞，初步构建转基因鸡的模型，为寻求制备转基因鸡的最佳方法提供实验依据和基础。
1、材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物、菌株及质粒
北京油鸡种蛋均购自于北京农科院畜牧研究所。宿主菌大肠杆菌E.coli DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司。pEGFPN1质粒载体由本实验室保存。
1.1.2 试验试剂
1) DNA marker：东盛生物科技有限公司
2) 限制性内切酶：NEB公司
3) 质粒小提、大提试剂盒：OMEGA公司
4) 氨苄青霉素：华美生物公司
5) 卡那霉素：华美生物公司
6) 琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒：北京博迈德科技发展有限公司
7） lipofectamine 3000：invitrogen公司
8） PI：Sigma公司
9） DAPI: Sigma公司
10）其他生化试剂：国内分析纯
1.1.3细胞培养用品
96孔黑色壁细胞培养板：Nunc公司
DMEM：Gibco公司
FBS：Gibco公司
胰蛋白酶：Sigma公司
1.1.4主要仪器设备
电泳仪：PS300B电泳仪，Hoefer公司
凝胶成像系统：BioRAD公司
80℃超低温冰箱：中科美菱
制冰机：日本 SANYO 公司
37℃恒温水浴仪：美国 LIFESCIENCE 公司
倒置荧光显微镜：Nikon公司，奥林巴斯公司
图像采集处理系统：美国Pixera公司
低速台式水平离心机：上海安亭科学仪器厂
高压灭菌锅：日本 SANYO 公司
高速冷冻离心机：BECKMAN 公司
低温离心机：Eppendorf公司
目录
摘要2
关键词2
Abstract2
Key words2
引言2
1 材料与方法3
1.1试验材料3
1.1.1 试验动物、菌株及质粒3
1.1.2 试验试剂 3
1.1.3 细胞培养用品 3
1.1.4 主要仪器设备 4
1.1.5 主要溶液配置 4
1.1.6 分析软件 5
1.2 实验方法 5
1.2.1 质粒的制备与线性化 5
1.2.2 回收目的DNA片段 8
1.2.3 cEXC由X期胚盘组织中体外分离 8
1.2.4 脂质体法转染9
1.2.5 细胞染色统计死亡率9
结果与分析 9
2.1 质粒的线性化10
2.2 转染结果11
2.3 细胞死亡率11
3 讨论 11
致谢13
参考文献14
脂质体介导法体外转染鸡胚干细胞的研究
引言
动物转基因技术是一种通过基因工程技术将外源基因整合到受体动物基因组中从而使其得以表达和遗传的生物技术，最早出现于20世纪70年代中期。随着转基因新技术的出现，转基因动物的制备效率大大提高，使得转基因表达的精确调控得以实现，从而使转基因动物的研究取得了飞速发展，甚至已经进入了产业化的应用阶段。随着转基因植物和转基因动物产品进入产业应用，转基因生物的安全性受到越来越多的关注。在转基因研究中，通常都使用完整重组 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072#
质粒进行直接转染。这样的载体骨架序列、抗性基因、标记基因的随机整合及遗传会成为不安全因素，令人担忧。载体骨架序列也会整合进染色体中[14]，确有研究证明载体骨架序列的整合会带来许多安全隐患。Muller等[5]认为载体骨架序列含有回文结构，这些回文结构能够使质粒与质粒之间形成稳定的二级结构，促进异常重组。Philip等[6]认为，当载体骨架序列被转录成RNA时，这些RNA就很可能干扰目的基因RNA的合成及加工，且载体骨架序列很可能与转基因的多拷贝有关。Stoger等[7]认为外源载体序列和目的基因序列一起整合会带来非常大的转基因位点，而大的转基因位点在立体结构上非常不稳定，易导致在转基因后代中位点的丢失和表达的沉默。如何避免抗性基因、标记基因带来的安全隐患己成为转基因研究的热点。目前，研究者多采用Cre/Loxp系统、FLP/FRT系统或RRS系统等途径将这些不利基因删除[8,9]。虽然采用Cre/Loxp重组酶系统可以将抗性基因或标志基因等去除，但该方法需要二次转染且技术繁杂[10]。在转基因植物中，将只含有转基因表达所需的基本元件(启动子、开放阅读框和终止子)而不含有载体骨架序列和选择性标记的线形DNA，相对于完整的重组质粒，用这种基因表达盒独立转移体直接转化不会降低转化率，而且外源基因的整合与稳定遗传也不会受到影响[11]，还有助于实现比较好的共表达[12,13]。这种方法在转基因水稻[14]、小麦[15]、葡萄[16]及甜瓜[17]中均获得成功。但是，基因表达盒直接转化是否能够使外源基因以较低拷贝数的简单方式直接整合，仍存在着一定的争议。利用这种技术进行动物方面的转基因研究也开始有所报道[18]。
转基因家禽有非常广泛的应用前景，但其应用价值还有赖于确立实用、可行的转基因制备方案。选择家禽作为转基因研究动物是因为其有两大优点，一是由于相对于哺乳动物，家禽胚胎较容易获得，操作方便。二是其能够产生有价值蛋白，是一种高效生物反应器。各种各样的方法已被尝试用于转基因鸡的制备，比如脂质体法、电转染法、慢病毒转染法等。尽管病毒转染法的转染效率较高，但其对胚胎具有一定的危险性。脂质体是由生物可降解组成，具有操作简便、毒性小、转染效率高、对基因无限制、又没有病毒作载体引发生物癌变或变异的可能[19]，且脂质载体的免疫原性通常较低[20]。
经过分析各方法优缺点，本实验拟采用脂质体转染的方法探讨制备转基因鸡的可行性，分别用单酶切、缺失抗性基因的pEGFPN1质粒，双顺反子基因转移体CMVEGFPpolyA和完整的pEGFPN1质粒体外转染鸡胚盘干细胞，初步构建转基因鸡的模型，为寻求制备转基因鸡的最佳方法提供实验依据和基础。
1、材料与方法
1.1试验材料
1.1.1试验动物、菌株及质粒
北京油鸡种蛋均购自于北京农科院畜牧研究所。宿主菌大肠杆菌E.coli DH5α购自天根生化科技（北京）有限公司。pEGFPN1质粒载体由本实验室保存。
1.1.2 试验试剂
1) DNA marker：东盛生物科技有限公司
2) 限制性内切酶：NEB公司
3) 质粒小提、大提试剂盒：OMEGA公司
4) 氨苄青霉素：华美生物公司
5) 卡那霉素：华美生物公司
6) 琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒：北京博迈德科技发展有限公司
7） lipofectamine 3000：invitrogen公司
8） PI：Sigma公司
9） DAPI: Sigma公司
10）其他生化试剂：国内分析纯
1.1.3细胞培养用品
96孔黑色壁细胞培养板：Nunc公司
DMEM：Gibco公司
FBS：Gibco公司
胰蛋白酶：Sigma公司
1.1.4主要仪器设备
电泳仪：PS300B电泳仪，Hoefer公司
凝胶成像系统：BioRAD公司
80℃超低温冰箱：中科美菱
制冰机：日本 SANYO 公司
37℃恒温水浴仪：美国 LIFESCIENCE 公司
倒置荧光显微镜：Nikon公司，奥林巴斯公司
图像采集处理系统：美国Pixera公司
低速台式水平离心机：上海安亭科学仪器厂
高压灭菌锅：日本 SANYO 公司
高速冷冻离心机：BECKMAN 公司
低温离心机：Eppendorf公司
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