母猪高膘妊娠对胎盘滋养层细胞凋亡发生的影响
母猪繁殖性能对于养猪业来说至关重要。妊娠母猪背膘过厚往往会导致繁殖性能的下降与胎盘功能的紊乱，但其影响机制的研究却鲜有报道。脂肪毒性即由脂肪异位沉积引起的组织细胞氧化应激、炎症反应和细胞凋亡，进而损伤组织细胞的结构和功能［1］。研究表明母体妊娠肥胖引起的繁殖力下降与胎盘脂肪毒性的发生有关，虽然在人、大鼠和山羊中均证实妊娠肥胖可引起胎盘脂肪毒性的发生，但在猪高膘妊娠是否同样会引起胎盘脂毒性的发生还未见报道［2］.因此，本文拟研究母猪高膘妊娠对胎盘绒毛细胞凋亡的影响，通过TUNEL荧光染色检测，免疫组化染色检测，Western blot 检测凋亡蛋白表达水平等方法，研究母猪高膘妊娠对胎盘滋养层细胞凋亡发生的影响，发现脂肪大量沉积在胎盘，会造成胎盘滋养层细胞的凋亡。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法1
1.1材料 1
1.1.1试验动物和分组 1
1.1.2饲养管理 2
1.1.3母猪背膘和分组 2
1.1.4实验材料的准备2
1.2实验过程 2
1.2.1TUNEL荧光染色检测2
1.2.2免疫组化染色检测 2
1.2.3Western blot 检测凋亡蛋白表达水平 2
2.结果与分析 3
2.1TUNEL荧光染色检测结果与分析3
2.2免疫组化染色检测结果与分析 4
2.3Western blot 检测凋亡蛋白结果与分析4
3.总结与讨论5
致谢6
参考文献6
母猪高膘妊娠对胎盘滋养层细胞凋亡发生的影响
引言
引言；膘情与母猪繁殖性能密切相关。膘情是母猪机体体况的一个重要指标，它反映的是母猪在不同生理阶段的营养状况和体能储备妊娠期高能量摄入会导致膘情过肥，影响子宫壁血液循环并导致子宫壁血液循环障碍，可能因为营养过剩而造成妊娠母猪过肥，从而造成胎盘滋养层细胞的凋亡。这可能与母猪在妊娠过程中的胎盘脂肪异位沉积有关，脂肪可以沉积在肝脏，形成脂肪肝，沉积在骨骼肌 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
，胰腺心肌，同样可以沉积在胎盘，脂肪大量沉积在胎盘，从而导致胎盘细胞的氧化应激反应，并造成胎盘细胞的凋亡。这可能与胎盘细胞在面对大量的脂肪异位沉积所导致的氧化应激反应和炎症反应有关［3］。
当细胞凋亡时线粒体膜电位的改变，会导致线粒体膜的通透性改变，使Cy C释放至细胞质中，导致Caspase3活化，造成一连串凋亡反应。细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，形成180200bp的DNA 片段。基因组DNA断裂时，暴露的3OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素 标记的dUTP 或者Brdu，从而可以通过荧光显微镜进行检测。
Caspases是细胞进入程序性死亡的特异性标志,已经越来越受到重视［4］。目前认为其发挥作用必须在激活物的作用下将其激活为活性形式,然后作用于相应的底物［5］,引起的变化包括:①阻遏细胞周期循环;②破坏细胞平衡状态及修复机制;③使细胞从周围的组织结构中脱落;④使维持细胞结构的物质解体。Caspase一经激活裂解其作用底物,细胞凋亡便不可逆地进入实施阶段。其中以Caspase 3较为引人注目［6］。Caspase 3在Caspases家族中属于凋亡效应亚类的Caspase蛋白酶,执行剪切细胞结构蛋白的作用,直接使细胞发生凋亡,是细胞凋亡过程中最重要的终末执行酶［7］。所以检测Caspase3表达和活性对研究细胞凋亡具有重要意义。
细胞凋亡发生时,水和溶质进入基质,引起线粒体的膨胀,内膜的膨胀导致外膜的破裂,从而释放包括细胞色素C在内的各种蛋白。同时线粒体形成足够大的运输通道,现已发现Bcl2、BclxL、Bax等在平面脂双层中能形成孔道,在脂质体中Bax能发生寡聚化形成具有高传导性的通道并且激活细胞色素C的释放［89］。Bax是细胞凋亡促进基因，Bax的过度表达可拮抗BCL2的保护效应而使细胞趋于死亡。所以测定Bax，Caspase 3，Cyc，Bcl2蛋白的表达对于测定细胞凋亡情况至关重要。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物和分组
本试验选择安徽某农牧公司良种猪场饲养的正常发情和受孕的纯种长白经产母猪共 20 头。根据背膘厚度分为 2 组：低膘妊娠组(1217 mm)母猪共 10 头、高膘妊娠组(2027 mm)母猪共10 头。
1.1.2饲养管理
试验猪只按猪场免疫程序进行常规免疫，自由饮水，妊娠期母猪每日 9:00、16:00各饲喂一次，饲喂干粉料，每日喂量 2.53.5 kg。哺乳期每日 9:00、14:00、17:30 各喂一次，每日喂量 5.86.3 kg。
1.1.3母猪背膘和分组
测定母猪背膘厚度连续测量 3 次，记录数据。背膘厚度在1217的定为LBF组，背膘厚度在2027的定为HBF组。
1.1.4实验材料的准备
TUNEL荧光染色检测试剂盒
免疫组化染色检测试剂盒
SDSPAGE 凝胶配制试剂盒
1.2实验过程
1.2.1TUNEL荧光染色检测
二甲苯中脱蜡510分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡510分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，2037℃作用1530分钟。 PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
1.2.2免疫组化染色检测
胎盘绒毛组织石蜡切片经水洗、二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后，PBS 洗 3 次，5 min?次1；切片放入柠檬酸钠抗原修复液中，煮沸 20 min，自然冷却至室温，PBS 洗 3 次，5 min 次1；每张切片滴加 2 滴 3%H2O2甲醇溶液，室温（15～25 ℃）封闭 10 min，PBS 洗 3 次，5 min?次1；滴加即用型山羊血清 50～100 μL，室温放置 20 min；滴加Caspase 3 一抗(1:200) 50～100 μL，4 ℃孵育过夜，PBS 洗 3，次，5 min?次1；滴加生物素二抗 50 μL，37 ℃孵育 30 min，PBS 洗 3 次，5 min?次1；每张切片加 2 滴现配的 DAB 染液，镜下调整染色时间；苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观测并拍照。取适量组织样本剪碎，加入冷的裂解缓冲液，匀浆后在冰上静置15min，吸取上清，取适量上清加入检测缓冲液并加入适量 AcDEVDpNA，在37℃下避光反应12小时，然后测定A405,计算Caspase 3活性。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言1
1材料与方法1
1.1材料 1
1.1.1试验动物和分组 1
1.1.2饲养管理 2
1.1.3母猪背膘和分组 2
1.1.4实验材料的准备2
1.2实验过程 2
1.2.1TUNEL荧光染色检测2
1.2.2免疫组化染色检测 2
1.2.3Western blot 检测凋亡蛋白表达水平 2
2.结果与分析 3
2.1TUNEL荧光染色检测结果与分析3
2.2免疫组化染色检测结果与分析 4
2.3Western blot 检测凋亡蛋白结果与分析4
3.总结与讨论5
致谢6
参考文献6
母猪高膘妊娠对胎盘滋养层细胞凋亡发生的影响
引言
引言；膘情与母猪繁殖性能密切相关。膘情是母猪机体体况的一个重要指标，它反映的是母猪在不同生理阶段的营养状况和体能储备妊娠期高能量摄入会导致膘情过肥，影响子宫壁血液循环并导致子宫壁血液循环障碍，可能因为营养过剩而造成妊娠母猪过肥，从而造成胎盘滋养层细胞的凋亡。这可能与母猪在妊娠过程中的胎盘脂肪异位沉积有关，脂肪可以沉积在肝脏，形成脂肪肝，沉积在骨骼肌 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
，胰腺心肌，同样可以沉积在胎盘，脂肪大量沉积在胎盘，从而导致胎盘细胞的氧化应激反应，并造成胎盘细胞的凋亡。这可能与胎盘细胞在面对大量的脂肪异位沉积所导致的氧化应激反应和炎症反应有关［3］。
当细胞凋亡时线粒体膜电位的改变，会导致线粒体膜的通透性改变，使Cy C释放至细胞质中，导致Caspase3活化，造成一连串凋亡反应。细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA，形成180200bp的DNA 片段。基因组DNA断裂时，暴露的3OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶的催化下加上荧光素 标记的dUTP 或者Brdu，从而可以通过荧光显微镜进行检测。
Caspases是细胞进入程序性死亡的特异性标志,已经越来越受到重视［4］。目前认为其发挥作用必须在激活物的作用下将其激活为活性形式,然后作用于相应的底物［5］,引起的变化包括:①阻遏细胞周期循环;②破坏细胞平衡状态及修复机制;③使细胞从周围的组织结构中脱落;④使维持细胞结构的物质解体。Caspase一经激活裂解其作用底物,细胞凋亡便不可逆地进入实施阶段。其中以Caspase 3较为引人注目［6］。Caspase 3在Caspases家族中属于凋亡效应亚类的Caspase蛋白酶,执行剪切细胞结构蛋白的作用,直接使细胞发生凋亡,是细胞凋亡过程中最重要的终末执行酶［7］。所以检测Caspase3表达和活性对研究细胞凋亡具有重要意义。
细胞凋亡发生时,水和溶质进入基质,引起线粒体的膨胀,内膜的膨胀导致外膜的破裂,从而释放包括细胞色素C在内的各种蛋白。同时线粒体形成足够大的运输通道,现已发现Bcl2、BclxL、Bax等在平面脂双层中能形成孔道,在脂质体中Bax能发生寡聚化形成具有高传导性的通道并且激活细胞色素C的释放［89］。Bax是细胞凋亡促进基因，Bax的过度表达可拮抗BCL2的保护效应而使细胞趋于死亡。所以测定Bax，Caspase 3，Cyc，Bcl2蛋白的表达对于测定细胞凋亡情况至关重要。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1试验动物和分组
本试验选择安徽某农牧公司良种猪场饲养的正常发情和受孕的纯种长白经产母猪共 20 头。根据背膘厚度分为 2 组：低膘妊娠组(1217 mm)母猪共 10 头、高膘妊娠组(2027 mm)母猪共10 头。
1.1.2饲养管理
试验猪只按猪场免疫程序进行常规免疫，自由饮水，妊娠期母猪每日 9:00、16:00各饲喂一次，饲喂干粉料，每日喂量 2.53.5 kg。哺乳期每日 9:00、14:00、17:30 各喂一次，每日喂量 5.86.3 kg。
1.1.3母猪背膘和分组
测定母猪背膘厚度连续测量 3 次，记录数据。背膘厚度在1217的定为LBF组，背膘厚度在2027的定为HBF组。
1.1.4实验材料的准备
TUNEL荧光染色检测试剂盒
免疫组化染色检测试剂盒
SDSPAGE 凝胶配制试剂盒
1.2实验过程
1.2.1TUNEL荧光染色检测
二甲苯中脱蜡510分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡510分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，2037℃作用1530分钟。 PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
1.2.2免疫组化染色检测
胎盘绒毛组织石蜡切片经水洗、二甲苯脱蜡和梯度酒精脱水后，PBS 洗 3 次，5 min?次1；切片放入柠檬酸钠抗原修复液中，煮沸 20 min，自然冷却至室温，PBS 洗 3 次，5 min 次1；每张切片滴加 2 滴 3%H2O2甲醇溶液，室温（15～25 ℃）封闭 10 min，PBS 洗 3 次，5 min?次1；滴加即用型山羊血清 50～100 μL，室温放置 20 min；滴加Caspase 3 一抗(1:200) 50～100 μL，4 ℃孵育过夜，PBS 洗 3，次，5 min?次1；滴加生物素二抗 50 μL，37 ℃孵育 30 min，PBS 洗 3 次，5 min?次1；每张切片加 2 滴现配的 DAB 染液，镜下调整染色时间；苏木素复染，二甲苯透明，中性树胶封片，显微镜下观测并拍照。取适量组织样本剪碎，加入冷的裂解缓冲液，匀浆后在冰上静置15min，吸取上清，取适量上清加入检测缓冲液并加入适量 AcDEVDpNA，在37℃下避光反应12小时，然后测定A405,计算Caspase 3活性。
版权保护: 本文由 hbsrm.com编辑，转载请保留链接: www.hbsrm.com/yxlw/dwyx/400.html
