肠出血性大肠杆菌噬菌体裂解酶的真核表达及生物活性检测
肠出血性大肠杆菌是一种食源性人畜共患肠道致病菌，严重威胁到人类的健康，成为全球性的公共卫生问题。噬菌体是一种可以裂解细菌的病毒，它可以表达出裂解酶。噬菌体裂解酶有着特异性强、稳定性好、效率高、安全性好等特点，可以用于耐药细菌的控制和治疗而不会破坏正常的菌群，有成为新一代抗菌药的潜力。本研究使用毕赤酵母表达系统表达出噬菌体TLL与噬菌体LJ的裂解酶。表达的裂解酶具有生物活性，不仅可以裂解大肠杆菌，还可以裂解金黄色葡萄球菌。
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 4
Key words 4
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 试验材料 5
1.1.1 菌株与质粒 5
1.1.2 试剂 5
1.1.3 仪器 5
1.1.4 溶液 5
1.1.5 引物 6
1.2 实验方法 6
1.2.1 P.pastoris菌株的纯化与增殖 6
1.2.2 目的基因的获得 6
1.2.3 重组质粒的构建、转化及鉴定 6
1.2.4 质粒线性化和回收 6
1.2.5 P.pastoris感受态的制备 6
1.2.6 毕赤酵母的电击转化 7
1.2.7 Mut+和Muts表型筛选 7
1.2.8 阳性转化子的筛选及鉴定 7
1.2.9 Mut+表型重组酵母的诱导表达 7
1.2.10 点样法初步测定裂解酶裂解大肠杆菌活性 8
1.2.11 点样法初步测定裂解酶裂解金黄色葡萄球菌活性 8
2 结果与分析 8
2.1 毕赤酵母表达克隆的构建及表达菌株的筛选 8
2.2 毕赤酵母的诱导表达及表达产物的鉴定 9
2.2.1 点样法检测生物活性实验 9
2.2.2 SDSPAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色实验 9
3 讨论 10
3.1 研究背景与意义 10
3.2 研究不足与展望 11
3.2.1 裂解酶表达 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
/> 3.2.2 裂解酶生物活性 11
致谢 12
参考文献： 12
肠出血性大肠杆菌噬菌体裂解酶的真核表达及生物活性检测
引言
肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）是一种食源性人畜共患肠道致病菌，能产生志贺毒素，可以导致vero细胞的死亡，也可引起人和多种畜禽感染、发病。EHEC自1982年在美国首次被发现起[1]，相继在英国、加拿大、日本、德国等国家暴发流行[2]。其血清型众多，典型代表是O157:H7和O104:H4，毒力极强，100个细菌即可致病。严重威胁到人类的健康，成为全球性的公共卫生问题。
以前，抗生素是治疗细菌性疾病最常用而且有效的武器，但随着抗生素的滥用，世界卫生组织发表报告确认世界的抗生素濒临枯竭，大肠杆菌病严重缺乏治疗方案，而且抗生素有可能增加溶血性尿毒综合征的发生风险[3]，所以人们需要寻找新的杀菌物质以预防、治疗肠出血性大肠杆菌病。
噬菌体（Bacteriophage，Phage）是由英国细菌学家Twort（1915）及法裔加拿大细菌学家D’Herelle（1917）分别发现的一类细菌病毒。他们在研究中发现，噬菌体具有使宿主细菌裂解的现象，从而提出了噬菌体应用于治疗的可能性[4]。
1958年，Jaco等人发现噬菌体内存在一种能裂解细菌的物质，并将其命名为endolysin，即裂解酶。Freimer等[5]随即在1959年报道了经过纯化的裂解酶仍具有杀菌能力。此后大量的研究表明噬菌体裂解酶能快速杀灭敏感细菌，因此可以用于耐药细菌的控制和治疗。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是1969年由Ogata等首次发现的甲醇营养型真核微生物，生长速度快、容易培养。作为真核表达系统，毕赤酵母可以对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化。
本研究使用巴斯德毕赤酵母表达系统成功表达出噬菌体TLL与噬菌体LJ的裂解酶，不仅可以裂解其宿主肠出血性大肠杆菌Z11，还可以裂解金黄色葡萄球菌YZ17。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株与质粒 P.pastoris菌株GS115、载体pPIC9K、肠出血性大肠杆菌Z11、金黄色葡萄球菌YZ17、噬菌体TLL的基因组与噬菌体LJ的基因组均为江苏省农业科学院农产品质量与检测研究所保存。
1.1.2 试剂 LB营养琼脂、LB肉汤、YPD液体培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司；甲醇购自国药集团化学试剂有限公司；Yeast extract、Peptone购自OXOID公司；YNB、DSorbitol购自南京钟鼎生物技术有限公司；EcoRⅠ酶、NotⅠ酶、T4 DNA连接酶购自BioLabs公司；SalⅠ酶、Taq酶购自TaKaRa公司；DH5α购自上海唯地生物技术有限公司；G418购自BioFROXX公司；Biotin购自BBI Life Sciences公司；蛋白预制胶、蛋白电泳液MOPS购自金斯瑞生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、高纯度质粒DNA小量试剂盒购自北京擎科新业生物技术有限公司；真菌基因组DNA快速抽提试剂盒购自生工生物工程股份有限公司。
1.1.3 仪器 超微量紫外可见分光光度计购自NanoVue公司；电热恒温水槽购自上海精宏实验设备有限公司；恒温混匀仪、离心机购自eppendorf公司；电穿孔仪、凝胶成像系统、梯度PCR仪、电转印槽购自BIO RAD公司；电泳仪电源购自北京市六一仪器厂；洁净工作台购自苏州真田洁净设备有限公司；生物安全柜购自苏州安泰空气技术有限公司；DHP9025型电热恒温培养箱购自上海一恒科技有限公司；DRP9082型电热恒温培养箱购自上海森信实验仪器有限公司；HYLC组合式摇床、HZLF160全温振荡培养箱购自太仓市强乐实验设备有限公司；电子天平购自HANGPING公司；高压灭菌锅购自南京基天生物技术有限责任公司；微量移液枪购自Thermo公司、Finnpipette公司和PhysioCare公司。
目录
摘要 4
关键词 4
Abstract 4
Key words 4
引言 4
1 材料与方法 5
1.1 试验材料 5
1.1.1 菌株与质粒 5
1.1.2 试剂 5
1.1.3 仪器 5
1.1.4 溶液 5
1.1.5 引物 6
1.2 实验方法 6
1.2.1 P.pastoris菌株的纯化与增殖 6
1.2.2 目的基因的获得 6
1.2.3 重组质粒的构建、转化及鉴定 6
1.2.4 质粒线性化和回收 6
1.2.5 P.pastoris感受态的制备 6
1.2.6 毕赤酵母的电击转化 7
1.2.7 Mut+和Muts表型筛选 7
1.2.8 阳性转化子的筛选及鉴定 7
1.2.9 Mut+表型重组酵母的诱导表达 7
1.2.10 点样法初步测定裂解酶裂解大肠杆菌活性 8
1.2.11 点样法初步测定裂解酶裂解金黄色葡萄球菌活性 8
2 结果与分析 8
2.1 毕赤酵母表达克隆的构建及表达菌株的筛选 8
2.2 毕赤酵母的诱导表达及表达产物的鉴定 9
2.2.1 点样法检测生物活性实验 9
2.2.2 SDSPAGE凝胶电泳及考马斯亮蓝染色实验 9
3 讨论 10
3.1 研究背景与意义 10
3.2 研究不足与展望 11
3.2.1 裂解酶表达 11
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
/> 3.2.2 裂解酶生物活性 11
致谢 12
参考文献： 12
肠出血性大肠杆菌噬菌体裂解酶的真核表达及生物活性检测
引言
肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic E.coli，EHEC）是一种食源性人畜共患肠道致病菌，能产生志贺毒素，可以导致vero细胞的死亡，也可引起人和多种畜禽感染、发病。EHEC自1982年在美国首次被发现起[1]，相继在英国、加拿大、日本、德国等国家暴发流行[2]。其血清型众多，典型代表是O157:H7和O104:H4，毒力极强，100个细菌即可致病。严重威胁到人类的健康，成为全球性的公共卫生问题。
以前，抗生素是治疗细菌性疾病最常用而且有效的武器，但随着抗生素的滥用，世界卫生组织发表报告确认世界的抗生素濒临枯竭，大肠杆菌病严重缺乏治疗方案，而且抗生素有可能增加溶血性尿毒综合征的发生风险[3]，所以人们需要寻找新的杀菌物质以预防、治疗肠出血性大肠杆菌病。
噬菌体（Bacteriophage，Phage）是由英国细菌学家Twort（1915）及法裔加拿大细菌学家D’Herelle（1917）分别发现的一类细菌病毒。他们在研究中发现，噬菌体具有使宿主细菌裂解的现象，从而提出了噬菌体应用于治疗的可能性[4]。
1958年，Jaco等人发现噬菌体内存在一种能裂解细菌的物质，并将其命名为endolysin，即裂解酶。Freimer等[5]随即在1959年报道了经过纯化的裂解酶仍具有杀菌能力。此后大量的研究表明噬菌体裂解酶能快速杀灭敏感细菌，因此可以用于耐药细菌的控制和治疗。
巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是1969年由Ogata等首次发现的甲醇营养型真核微生物，生长速度快、容易培养。作为真核表达系统，毕赤酵母可以对表达的蛋白进行翻译后的加工与修饰，从而使表达出的蛋白具有生物活性；在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于细胞内，又可分泌到胞外，自身分泌的蛋白非常少，十分有利于纯化。
本研究使用巴斯德毕赤酵母表达系统成功表达出噬菌体TLL与噬菌体LJ的裂解酶，不仅可以裂解其宿主肠出血性大肠杆菌Z11，还可以裂解金黄色葡萄球菌YZ17。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株与质粒 P.pastoris菌株GS115、载体pPIC9K、肠出血性大肠杆菌Z11、金黄色葡萄球菌YZ17、噬菌体TLL的基因组与噬菌体LJ的基因组均为江苏省农业科学院农产品质量与检测研究所保存。
1.1.2 试剂 LB营养琼脂、LB肉汤、YPD液体培养基购自青岛高科园海博生物技术有限公司；琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限责任公司；甲醇购自国药集团化学试剂有限公司；Yeast extract、Peptone购自OXOID公司；YNB、DSorbitol购自南京钟鼎生物技术有限公司；EcoRⅠ酶、NotⅠ酶、T4 DNA连接酶购自BioLabs公司；SalⅠ酶、Taq酶购自TaKaRa公司；DH5α购自上海唯地生物技术有限公司；G418购自BioFROXX公司；Biotin购自BBI Life Sciences公司；蛋白预制胶、蛋白电泳液MOPS购自金斯瑞生物科技有限公司；DNA凝胶回收试剂盒、高纯度质粒DNA小量试剂盒购自北京擎科新业生物技术有限公司；真菌基因组DNA快速抽提试剂盒购自生工生物工程股份有限公司。
1.1.3 仪器 超微量紫外可见分光光度计购自NanoVue公司；电热恒温水槽购自上海精宏实验设备有限公司；恒温混匀仪、离心机购自eppendorf公司；电穿孔仪、凝胶成像系统、梯度PCR仪、电转印槽购自BIO RAD公司；电泳仪电源购自北京市六一仪器厂；洁净工作台购自苏州真田洁净设备有限公司；生物安全柜购自苏州安泰空气技术有限公司；DHP9025型电热恒温培养箱购自上海一恒科技有限公司；DRP9082型电热恒温培养箱购自上海森信实验仪器有限公司；HYLC组合式摇床、HZLF160全温振荡培养箱购自太仓市强乐实验设备有限公司；电子天平购自HANGPING公司；高压灭菌锅购自南京基天生物技术有限责任公司；微量移液枪购自Thermo公司、Finnpipette公司和PhysioCare公司。
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