粪便孕酮酶免测定法在母猪早期妊娠诊断中的研究
粪便孕酮酶免测定法在母猪早期妊娠诊断中的研究[20200510204512]
摘要：在母猪的繁殖周期中，孕酮(P4)含量是判断母猪卵巢机能状态的重要指标，本试验采集了配种后第21-25d母猪（共122头）的粪便作为检测对象，建立了粪样孕酮酶免法: 检测灵敏度为12.13ng/g，平均回收率为97.9%，板内和板间变异系数分别为3.73%和7.96%，用50%置换法测得孕酮抗体与雌二醇、雌三醇、雌酮交叉反应率均小于0.01%，与睾酮交叉反应率为0.35%。将该方法用于测定母猪粪样中孕酮含量，进行早期妊娠诊断。结果表明诊断妊娠的准确率达96.1%，诊断空怀的准确率达80%。
关键字：孕酮；酶免测定；母猪；粪样
Enzyme immunoassay of fecal progesterone for pregnant diagnosis in sows
Student majoring in Animal Science Li Zhen
Tutor Shi Fangxiong
Abstract:?During the reproductive cycle?of sows,?progesterone?(P4)?is an important index to determine the?ovarian?function.?Feces?of?sows after breeding in?21-25d were collected as detection object, the experiment established?the?fecal?progesterone ELISA: the detection sensitivity is?12.13 ng/g,?the average?recovery rate was 97.9%,?intra-assay coeffecients of variation were 3.73% and the inter-assay CVs were?7.96%,?the cross-reactivity of estradiol, estriol, estrone were less than 0.01%, the cross-reactivity of testosterone was 0.35% by 50% displacement measurement. The methods were used to the?determination of progesterone?in feces?of?sows,?the diagnosis of early pregnancy.?The results show that the accuracy?rate of diagnosis?of pregnancy?was 97.77%,?the accuracy?rate of diagnosis of?barren was 80%.
引言：孕酮（Progesterone, P4)是一种类固醇激素，主要由卵巢的黄体细胞产生，极微量的孕酮即能发挥强大的生物效应。孕酮的浓度与发情周期妊娠等高度相关，在发情期中最低，到发情周期的中期因黄体成熟而达到最高水平，孕酮主要的生物学作用是调控生殖系统，参与妊娠识别和妊娠维持[1-3] 。在母畜的繁殖周期中，测定体液孕酮含量，依据其变化可用于早期妊娠诊断[4，5]和发情鉴定[6] 等。
目前用于激素水平测定的主要是放射免疫测定（RIA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）。RIA存在放射性物质污染的危害,测试仪器昂贵, 检测程序繁琐等弊病。ELISA设备要求简单, 操作简便, 国内一些学者先后建立P4、E2和睾酮的酶免测定法并作了初步应用[7-9]。目前ELISA在粪便临床化验中的应用主要是检测寄生虫以及细菌、真菌毒素，在性激素检测中主要用于测定血液、唾液或尿液中的激素含量[10，11]。随着酶免激素测定方法的逐步成熟，通过测定粪样、尿液和唾液的孕酮浓度代替血液来进行母猪早期妊娠诊断[12，13]成为一种可能。
目前，通常运用酶免疫测定法测定动物血样进行孕激素含量，但这种采样方法会对动物产生一定的应激并且繁琐 由于类固醇激素在动物血液中迅速被结合，然后通过不同的途径分泌到尿液和经胆汁排到肠道中，再与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合，形成水溶性的无活性的葡萄糖苷酸或硫酸盐而被排泄到粪便和尿液中［14］。此外，Bercovitz(1978)开始测定粪便类固醇用于确定鸟类的性别, 80年代又应用于一些农畜。粪便类固醇分析法具有采样简便、不侵扰目标动物的优点, 使动物处于自然的生理状态, 激素分泌不会产生额外变化[15]。
因此，探索利用粪便等样品测定孕酮含量的方法是临床应用的需要，本试验采集了配种后第21-25d母猪（共122头）的粪便作为检测对象，建立了简便实用的母猪粪样孕酮含量的酶免疫测定法，以期用于母猪发情检查、妊娠诊断及卵巢机能监控。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器设备
酶标仪为美国Bio-TEK产品，型号为ELX800；高速离心机TG16-WS（海门其林贝尔仪器厂）；精密电子天平（LIBROR AEG-120）；磁力搅拌器GL-3250B型（海门其林贝尔仪器厂）；振荡器、加样器、烘箱、96孔酶标板（购于Greiner公司）、电热恒温水槽、电热恒温箱（上海一恒科技有限公司）、WED-2000AV型兽用掌上。
1.1.2 试验药品及试剂
Na2CO3 、NaHCO3、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、Nacl、BSA 、吐温-20 OPD、柠檬酸、孕酮多克隆抗体、酶标抗原等。
1.1.3要配置的溶液
包被缓冲液、测定缓冲液、封闭缓冲液、洗涤液、底物液、终止液、Tris-盐酸缓冲液等。
1.1.4 粪便收集和粪便溶液的制备
粪便收集：母猪来源于灌云县畜旺生猪养殖场, 所有母猪均在相同条件下进行饲养管理，采集了配种后第21-25d母猪（共122头）的粪便作为检测对象。收集粪便时将母猪保持在其摊位上，手上戴一个塑料手套插入到母猪直肠，取少量的粪便投入的塑料试管中，用0.05％叠氮化钠作为防腐剂添加，然后带回实验室置于-20℃冰箱待测。
粪便溶液的制备：收集的母猪粪样称0.5g溶于20mL蒸馏水中，充分搅拌后，离心（3000 r/min，10 min），取上清液在在-20℃下冷冻，作为粪便溶液进行孕激素的检测。
1.2 方法
1.2.1 ELISA的反应原理和流程
（1）ELISA的原理
竞争性ELISA的原理是先将抗体包被于固相，之后加入一定待测样本和一定量的酶标抗原结合物，此时它们能竞争性的与固相抗体结合，再经洗涤后加底物显色，测定它们的OD492值，根据标准曲线计算出待测物含量。
（2）竞争 ELISA 操作程序：
1抗体包被，用最佳包被液稀释抗体，以最佳浓度包被在酶标板，每孔200ul，置 4 ℃ 冰箱过夜。
2 封闭，取最佳封闭液封闭酶标板，每孔280ul，37℃水浴2h。
3 洗涤，弃去孔内液体，加入洗涤液300ul/孔，每次3min，如此重复3次后，在吸水纸上拍干。
4 加样：加入一定浓度的待检样品溶液100ul/孔及最佳工作浓度的酶标抗原，每孔100ul。
5 洗涤：同前。
6 加底物：加入新配的底物溶液OPD-H2O2，100ul/孔，37℃避光反应30min。
7 终止：加入浓度2mol/L H2SO4 50ul/孔。用酶联仪读出 OD492nm值。
1.2.2 孕酮抗体最佳包被浓度和酶标孕酮工作浓度的选择
采用棋盘方阵滴定法同时确定最佳抗体和酶标抗原的工作浓度，将冻干的P4抗体用碳酸盐缓冲液分别稀释为1/5000、1/10000、1/20000、1/50000、1/100000的稀释梯度，纵向每孔200ul包被于酶标板上，4℃过夜。封闭液封闭2h后弃掉孔内液体洗涤3次。加入稀释倍数分别为5000、10000、20000、50000、100000倍的酶标孕酮100ul/孔，37℃温育1h。洗涤后加底物显色，终止反应，测定OD492nm值。选取OD492nm值最接近1.0的孔所对应的抗体包被浓度和酶标抗原浓度为最适包被抗体和酶标抗原的工作浓度。
1.2.3标准曲线的制作
按照直接竞争ELISA操作步骤，以试验所得的最佳的P4抗体浓度、酶标孕酮工作浓度和其他的最适条件制作标准曲线。用不含待测样品稀释孕酮标准品，制备不同浓度的标准品稀释液。以标准准样本测定的吸光值的结合率为纵坐标，标准品浓度为横坐标作图，既得标准曲线。然后用数学模型E/E0-lnC将标准曲线线性化。
1.2.4方法学鉴定
酶免疫测定方法通常用灵敏度、精密度、准确度和特异性等指标来进行验证和鉴定。灵敏度指应用该方法能检测出待测抗原的最低量，检出量越小，灵敏度越高。精密度又称重复性，反映测定方法多次测定所得结果的重复读，通常用变异系数来表示。准确度即测定结果接近真值的程度，常常用回收率测定。特异性指测定方法对被侧抗原的专一程度，一般用抗体交叉反应表示。因而，本实验用这几个指标进行方法学鉴。
（1）检测方法的灵敏度
竞争抑制法：测定样品的OD值，然后，根据测定结果，求出它的平均数M和标准差(SD)计算出M-2SD，再将此值代入方程，计算出检测的灵敏度。
（2）检测方法的准确度
通常规定用回收试验来确定准确性，其指标为回收率。回收率表示方法是，测定的结果与已知理论浓度相比较，回收率=测定值/添加值×100%，根据资料报导试剂盒回收率在 90%-l10%范围内符合要求。
（3）检测方法的精密度
在医学统计学中，用标准差和变异系数表示测定的精确度。通常以板间变异系数和板内变异系数表示试剂盒的精确度。变异系数为标准差与其均值的比值，以百分数表示。
（4）检测方法的特异性
特异性通常以交叉反应率表示，是以被分析物及其类似物(analogue)在剂量-反应曲线上50％结合率时两者用量的比，以百分数表示。本实验选择了孕酮、雌二醇、雌三醇、雌酮、睾酮五种物质进行交叉反应测定。
1.2.5 母猪早期妊娠诊断
以妊娠母猪粪样中孕酮浓度的平均数加减两个标准差作为基准，当配种后母猪粪样中孕酮的含量超过200ng/g粪样时，就可确认其妊娠；以空怀猪粪样中孕酮浓度的平均数加减两个标准差为基准，小于200ng/g粪样时，可初步确认其空怀。
2.结果与分析
2.1选择孕酮抗体最佳包被浓度和酶标孕酮工作浓度
由测定结果可知，最适包被抗体和酶标抗原的工作浓度为1.0546。
表1. 酶标抗原稀释度的选择
酶标抗原稀释度
1/5000 1/10000 1/20000 1/50000 1/100000
抗体稀释度 1/5000 3.8242 3.0504 2.0656 0.7787 0.3105
1/10000 3.5514 2.4568 1.1650 0.4864 0.2989
1/20000 3.4313 2.2407 1.0546 0.4205 0.2493
1/50000 3.0226 2.0465 0.9244 0.3440 0.2179
1/100000 2.4426 1.6768 0.7999 0.3092 0.1998
2.2测定粪样孕酮酶联免疫法的建立
将定量的孕酮标准进行梯度稀释，建立的标准曲线。
图1 孕酮标准标准曲线的建立
结合率与孕酮浓度的回归方程式为: Y= -10.71 log x+62.751 r2= -0.9947。
2.3方法学鉴定
2.3.1方法学灵敏度
根据测定结果，求出它的平均数M和标准差(SD)计算出M-2SD，再将此值代入方程，计算出检测的灵敏度为12.13ng/g。
表2.样品的灵敏度试验
样品OD值 0.8962 0.8985 0.8283 0.8827 0.8295 0.834 0.8673 0.8714
0.8751 0.8149 0.861 0.8644 0.899 0.8555 0.8401
平均值（M） 0.8612
标准差（SD） 0.0271
M-2SD 0.8069
回归方程 Y= -10.71 log x+62.751 r2= -0.9947
灵敏度（ng/g） 12.13 ng/g
2.3.2方法学准确度
表3. 样品的回收率试验
孕酮浓度（ng/mL） 0.1 5 50
OD值 0.8876 0.8754 0.4373 0.4798 0.1931 0.2008
0.8883 0.8996 0.4803 0.4568 0.2020 0.2083
0.8759 0.8780 0.4545 0.4752 0.1932 0.1952
OD平均值 0.8841 0.4640 0.1988
线性方程 Y= -10.71 log x+62.751 r2= -0.9947
孕酮浓度（ng/Ml） 0.09 4.65 54.85
回收率（%） 91 93 109.7
回收率平均值（%） 97.9
由上表3可以看出，标准孕酮浓度为0.1ng/mL、5ng/mL、50ng/mL时，由回收率=测定值/添加值×100%计算得回收率分别为91%、93%、109.7%，回收率在90%-110%之间。平均回收率为97.9%。
2.3.3方法学精密度
表4.样品的精密度试验
P4（ng/mL） 批内误差 批间误差
平均结合率（%）±标准差 平均结合率（%）±标准差(变异系数CV%)
10 32.87 ±0.97 61.58 ±9.49 (15.41)
5 41.62 ±1.10 70.52 ±9.76 (13.84)
2 57.52 ±4.25 78.71 ±8.05 (10.23)
1 66.73 ±3.02 82.76 ±5.23 (6.31)
0.5 75.98 ±3.38 86.32 ±4.64 (5.37)
0.2 83.08 ±2.93 90.14 ±4.96 (5.50)
0.1 87.89 ±1.63 93.29 ±4.65 (4.99)
0.05 92.08±2.81 96.01 ±1.95 (2.03)
平均值 67.22±2.51批内变异： 3.73% 批间总变异：7.96%
本试验，批内差异以标准曲线的批内变异系数（CV）表示，CV%=SD均值/平均结合率均值×100%=2.51/67.22×100%=3.73%，批间总变异为7.96%。
2.3.4方法学特异性
表5.样品的特异性试验
竞争物种类 交叉反应率（%）
雌二醇 <0.01%
雌三醇 <0.01%
雌酮 <0.01%
睾酮 0.35%
由上表5可以看出，用50%置换法测得孕酮抗体与雌二醇、雌三醇、雌酮交叉反应率均小于0.01% ，与睾酮交叉反应率为0.35%。
2.4母猪粪样中孕酮浓度测定
图2.母猪粪便中孕酮浓度分布
用本试验建立的方法测定粪样中孕酮含量，母猪的早期妊娠诊断以粪样中200ng/g的孕酮浓度为标准进行判定，当配种后母猪粪样中孕酮的含量超过200ng/g粪样时，就可确认其妊娠；小于200ng/g粪样时，可初步确认其空怀。
表6.ELISA诊断的妊娠与空怀试验
配种后的天数（配种当天为第0天） 空怀 总数
21 22 23 24 25
检查的母猪头数 18 21 23 22 18 20 122
通过ELISA诊断的妊娠数 16 21 23 21 17 98
通过ELISA诊断的空怀数 16
ELISA诊断妊娠的准确率(％) 88.9 100 100 95.5 94.4 96.1
ELISA诊断空怀的准确率(％) 80
由所测结果可知，依据粪样中的孕酮含量进行早期妊娠诊断，诊断妊娠的准确率达98/102= 96.1%，诊断空怀的准确率达16/20=80%。
3.讨论
母畜的粪或血液中的孕酮的含量变化是卵巢上黄体发育的结果，是母畜卵巢功能的体现，母畜周期性发情的实质是卵巢上卵泡与黄体的交替发育，反映到粪便中是雌二醇与孕酮含量的周期性变化，在发情期，由于卵巢上黄体退化、卵泡发育，粪中孕酮含量很低，而雌二醇含量较高；如果母畜发情输精后受精、妊娠，则发情后形成的周期黄体不再被子宫内膜分泌的前列腺素所溶解退化，周期性发情终止，形成妊娠黄体，在下个发情期到来的时间内，粪中的孕酮含量维持在较高水平。另外，Hulten等报告称通过测定血浆孕酮进行早期妊娠诊断测定时间是从配种后19天到23天，由于相对于血液中的孕酮含量，在粪便中的孕酮含度的变化有约2天的延迟。因此本试验以配种后第21-25d母猪的粪便作为检测对象，粪样中200ng/g的孕酮浓度为标准进行判定，当配种后母猪粪样中孕酮的含量大于200ng/g 粪样时，就可确认其妊娠；小于200ng/g粪样时，可初步确认其空怀。该结果与Masaharu 等(2010)的研究结果基本相似。
本试验成功得建立了母猪粪便孕酮酶免法，在试验过程中得到的标准曲线标准曲线采用了E/E0-lnC的数学模型可以定量测定出样品中孕酮的含量。对粪样孕酮酶免法测定灵敏度为12.13ng/g；平均回收率为97.9%，板内和板间变异系数分别为3.73%和7.96%，用50%置换法测得孕酮抗体与雌二醇、雌三醇、雌酮交叉反应率均小于0.01%，与睾酮交叉反应率为0.35%。
与采集血样相比，母猪粪便孕酮酶免法具有采样方便，操作简单，无需使用微量取液器等优点，可用于母猪发情检查、妊娠诊断等。
致谢
特别感谢大学动物繁殖研究室的冯建刚师兄在我实验进展、论文撰写和生活等方面给予的关心和无私的帮助。
最后,感谢我的家人和所有亲人朋友对我多年求学道路上给予的物质和精神上的支持与鼓励,正是他们的支持与鼓励才使我能够不断战胜困难,顺利完成学业。
参考文献
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1主要仪器设备2
1.1.2试验药品及试剂 2
1.1.3要配置的溶液 2
1.1.4粪便收集和粪便溶液的制备2
1.2方法 2
1.2.1 ELISA的反应原理和流程2
1.2.2孕酮抗体最佳包被浓度和酶标孕酮工作浓度的选择2
1.2.3标准曲线的制作2
1.2.4方法学鉴定3
1.2.5母猪早期妊娠诊断
2结果与分析3
2.1选择孕酮抗体最佳包被浓度和酶标孕酮工作浓度3
2.2测定粪样孕酮酶联免疫法的建立3
2.3方法学鉴定4
2.3.1方法学灵敏度4
2.3.2方法学准确度4
2.3.3方法学精密度4
2.3.4方法学特异性5
2.4母猪粪样中孕酮浓度测定5
3讨论6
致谢6
参考文献7
粪便孕酮酶免测定法在母猪早期妊娠诊断中的研究
引言
摘要：在母猪的繁殖周期中，孕酮(P4)含量是判断母猪卵巢机能状态的重要指标，本试验采集了配种后第21-25d母猪（共122头）的粪便作为检测对象，建立了粪样孕酮酶免法: 检测灵敏度为12.13ng/g，平均回收率为97.9%，板内和板间变异系数分别为3.73%和7.96%，用50%置换法测得孕酮抗体与雌二醇、雌三醇、雌酮交叉反应率均小于0.01%，与睾酮交叉反应率为0.35%。将该方法用于测定母猪粪样中孕酮含量，进行早期妊娠诊断。结果表明诊断妊娠的准确率达96.1%，诊断空怀的准确率达80%。
关键字：孕酮；酶免测定；母猪；粪样
Enzyme immunoassay of fecal progesterone for pregnant diagnosis in sows
Student majoring in Animal Science Li Zhen
Tutor Shi Fangxiong
Abstract:?During the reproductive cycle?of sows,?progesterone?(P4)?is an important index to determine the?ovarian?function.?Feces?of?sows after breeding in?21-25d were collected as detection object, the experiment established?the?fecal?progesterone ELISA: the detection sensitivity is?12.13 ng/g,?the average?recovery rate was 97.9%,?intra-assay coeffecients of variation were 3.73% and the inter-assay CVs were?7.96%,?the cross-reactivity of estradiol, estriol, estrone were less than 0.01%, the cross-reactivity of testosterone was 0.35% by 50% displacement measurement. The methods were used to the?determination of progesterone?in feces?of?sows,?the diagnosis of early pregnancy.?The results show that the accuracy?rate of diagnosis?of pregnancy?was 97.77%,?the accuracy?rate of diagnosis of?barren was 80%.
引言：孕酮（Progesterone, P4)是一种类固醇激素，主要由卵巢的黄体细胞产生，极微量的孕酮即能发挥强大的生物效应。孕酮的浓度与发情周期妊娠等高度相关，在发情期中最低，到发情周期的中期因黄体成熟而达到最高水平，孕酮主要的生物学作用是调控生殖系统，参与妊娠识别和妊娠维持[1-3] 。在母畜的繁殖周期中，测定体液孕酮含量，依据其变化可用于早期妊娠诊断[4，5]和发情鉴定[6] 等。
目前用于激素水平测定的主要是放射免疫测定（RIA）和酶联免疫吸附测定（ELISA）。RIA存在放射性物质污染的危害,测试仪器昂贵, 检测程序繁琐等弊病。ELISA设备要求简单, 操作简便, 国内一些学者先后建立P4、E2和睾酮的酶免测定法并作了初步应用[7-9]。目前ELISA在粪便临床化验中的应用主要是检测寄生虫以及细菌、真菌毒素，在性激素检测中主要用于测定血液、唾液或尿液中的激素含量[10，11]。随着酶免激素测定方法的逐步成熟，通过测定粪样、尿液和唾液的孕酮浓度代替血液来进行母猪早期妊娠诊断[12，13]成为一种可能。
目前，通常运用酶免疫测定法测定动物血样进行孕激素含量，但这种采样方法会对动物产生一定的应激并且繁琐 由于类固醇激素在动物血液中迅速被结合，然后通过不同的途径分泌到尿液和经胆汁排到肠道中，再与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合，形成水溶性的无活性的葡萄糖苷酸或硫酸盐而被排泄到粪便和尿液中［14］。此外，Bercovitz(1978)开始测定粪便类固醇用于确定鸟类的性别, 80年代又应用于一些农畜。粪便类固醇分析法具有采样简便、不侵扰目标动物的优点, 使动物处于自然的生理状态, 激素分泌不会产生额外变化[15]。
因此，探索利用粪便等样品测定孕酮含量的方法是临床应用的需要，本试验采集了配种后第21-25d母猪（共122头）的粪便作为检测对象，建立了简便实用的母猪粪样孕酮含量的酶免疫测定法，以期用于母猪发情检查、妊娠诊断及卵巢机能监控。
1.材料与方法
1.1 材料
1.1.1 主要仪器设备
酶标仪为美国Bio-TEK产品，型号为ELX800；高速离心机TG16-WS（海门其林贝尔仪器厂）；精密电子天平（LIBROR AEG-120）；磁力搅拌器GL-3250B型（海门其林贝尔仪器厂）；振荡器、加样器、烘箱、96孔酶标板（购于Greiner公司）、电热恒温水槽、电热恒温箱（上海一恒科技有限公司）、WED-2000AV型兽用掌上。
1.1.2 试验药品及试剂
Na2CO3 、NaHCO3、Na2HPO4·12H2O、NaH2PO4·2H2O、Nacl、BSA 、吐温-20 OPD、柠檬酸、孕酮多克隆抗体、酶标抗原等。
1.1.3要配置的溶液
包被缓冲液、测定缓冲液、封闭缓冲液、洗涤液、底物液、终止液、Tris-盐酸缓冲液等。
1.1.4 粪便收集和粪便溶液的制备
粪便收集：母猪来源于灌云县畜旺生猪养殖场, 所有母猪均在相同条件下进行饲养管理，采集了配种后第21-25d母猪（共122头）的粪便作为检测对象。收集粪便时将母猪保持在其摊位上，手上戴一个塑料手套插入到母猪直肠，取少量的粪便投入的塑料试管中，用0.05％叠氮化钠作为防腐剂添加，然后带回实验室置于-20℃冰箱待测。
粪便溶液的制备：收集的母猪粪样称0.5g溶于20mL蒸馏水中，充分搅拌后，离心（3000 r/min，10 min），取上清液在在-20℃下冷冻，作为粪便溶液进行孕激素的检测。
1.2 方法
1.2.1 ELISA的反应原理和流程
（1）ELISA的原理
竞争性ELISA的原理是先将抗体包被于固相，之后加入一定待测样本和一定量的酶标抗原结合物，此时它们能竞争性的与固相抗体结合，再经洗涤后加底物显色，测定它们的OD492值，根据标准曲线计算出待测物含量。
（2）竞争 ELISA 操作程序：
1抗体包被，用最佳包被液稀释抗体，以最佳浓度包被在酶标板，每孔200ul，置 4 ℃ 冰箱过夜。
2 封闭，取最佳封闭液封闭酶标板，每孔280ul，37℃水浴2h。
3 洗涤，弃去孔内液体，加入洗涤液300ul/孔，每次3min，如此重复3次后，在吸水纸上拍干。
4 加样：加入一定浓度的待检样品溶液100ul/孔及最佳工作浓度的酶标抗原，每孔100ul。
5 洗涤：同前。
6 加底物：加入新配的底物溶液OPD-H2O2，100ul/孔，37℃避光反应30min。
7 终止：加入浓度2mol/L H2SO4 50ul/孔。用酶联仪读出 OD492nm值。
1.2.2 孕酮抗体最佳包被浓度和酶标孕酮工作浓度的选择
采用棋盘方阵滴定法同时确定最佳抗体和酶标抗原的工作浓度，将冻干的P4抗体用碳酸盐缓冲液分别稀释为1/5000、1/10000、1/20000、1/50000、1/100000的稀释梯度，纵向每孔200ul包被于酶标板上，4℃过夜。封闭液封闭2h后弃掉孔内液体洗涤3次。加入稀释倍数分别为5000、10000、20000、50000、100000倍的酶标孕酮100ul/孔，37℃温育1h。洗涤后加底物显色，终止反应，测定OD492nm值。选取OD492nm值最接近1.0的孔所对应的抗体包被浓度和酶标抗原浓度为最适包被抗体和酶标抗原的工作浓度。
1.2.3标准曲线的制作
按照直接竞争ELISA操作步骤，以试验所得的最佳的P4抗体浓度、酶标孕酮工作浓度和其他的最适条件制作标准曲线。用不含待测样品稀释孕酮标准品，制备不同浓度的标准品稀释液。以标准准样本测定的吸光值的结合率为纵坐标，标准品浓度为横坐标作图，既得标准曲线。然后用数学模型E/E0-lnC将标准曲线线性化。
1.2.4方法学鉴定
酶免疫测定方法通常用灵敏度、精密度、准确度和特异性等指标来进行验证和鉴定。灵敏度指应用该方法能检测出待测抗原的最低量，检出量越小，灵敏度越高。精密度又称重复性，反映测定方法多次测定所得结果的重复读，通常用变异系数来表示。准确度即测定结果接近真值的程度，常常用回收率测定。特异性指测定方法对被侧抗原的专一程度，一般用抗体交叉反应表示。因而，本实验用这几个指标进行方法学鉴。
（1）检测方法的灵敏度
竞争抑制法：测定样品的OD值，然后，根据测定结果，求出它的平均数M和标准差(SD)计算出M-2SD，再将此值代入方程，计算出检测的灵敏度。
（2）检测方法的准确度
通常规定用回收试验来确定准确性，其指标为回收率。回收率表示方法是，测定的结果与已知理论浓度相比较，回收率=测定值/添加值×100%，根据资料报导试剂盒回收率在 90%-l10%范围内符合要求。
（3）检测方法的精密度
在医学统计学中，用标准差和变异系数表示测定的精确度。通常以板间变异系数和板内变异系数表示试剂盒的精确度。变异系数为标准差与其均值的比值，以百分数表示。
（4）检测方法的特异性
特异性通常以交叉反应率表示，是以被分析物及其类似物(analogue)在剂量-反应曲线上50％结合率时两者用量的比，以百分数表示。本实验选择了孕酮、雌二醇、雌三醇、雌酮、睾酮五种物质进行交叉反应测定。
1.2.5 母猪早期妊娠诊断
以妊娠母猪粪样中孕酮浓度的平均数加减两个标准差作为基准，当配种后母猪粪样中孕酮的含量超过200ng/g粪样时，就可确认其妊娠；以空怀猪粪样中孕酮浓度的平均数加减两个标准差为基准，小于200ng/g粪样时，可初步确认其空怀。
2.结果与分析
2.1选择孕酮抗体最佳包被浓度和酶标孕酮工作浓度
由测定结果可知，最适包被抗体和酶标抗原的工作浓度为1.0546。
表1. 酶标抗原稀释度的选择
酶标抗原稀释度
1/5000 1/10000 1/20000 1/50000 1/100000
抗体稀释度 1/5000 3.8242 3.0504 2.0656 0.7787 0.3105
1/10000 3.5514 2.4568 1.1650 0.4864 0.2989
1/20000 3.4313 2.2407 1.0546 0.4205 0.2493
1/50000 3.0226 2.0465 0.9244 0.3440 0.2179
1/100000 2.4426 1.6768 0.7999 0.3092 0.1998
2.2测定粪样孕酮酶联免疫法的建立
将定量的孕酮标准进行梯度稀释，建立的标准曲线。
图1 孕酮标准标准曲线的建立
结合率与孕酮浓度的回归方程式为: Y= -10.71 log x+62.751 r2= -0.9947。
2.3方法学鉴定
2.3.1方法学灵敏度
根据测定结果，求出它的平均数M和标准差(SD)计算出M-2SD，再将此值代入方程，计算出检测的灵敏度为12.13ng/g。
表2.样品的灵敏度试验
样品OD值 0.8962 0.8985 0.8283 0.8827 0.8295 0.834 0.8673 0.8714
0.8751 0.8149 0.861 0.8644 0.899 0.8555 0.8401
平均值（M） 0.8612
标准差（SD） 0.0271
M-2SD 0.8069
回归方程 Y= -10.71 log x+62.751 r2= -0.9947
灵敏度（ng/g） 12.13 ng/g
2.3.2方法学准确度
表3. 样品的回收率试验
孕酮浓度（ng/mL） 0.1 5 50
OD值 0.8876 0.8754 0.4373 0.4798 0.1931 0.2008
0.8883 0.8996 0.4803 0.4568 0.2020 0.2083
0.8759 0.8780 0.4545 0.4752 0.1932 0.1952
OD平均值 0.8841 0.4640 0.1988
线性方程 Y= -10.71 log x+62.751 r2= -0.9947
孕酮浓度（ng/Ml） 0.09 4.65 54.85
回收率（%） 91 93 109.7
回收率平均值（%） 97.9
由上表3可以看出，标准孕酮浓度为0.1ng/mL、5ng/mL、50ng/mL时，由回收率=测定值/添加值×100%计算得回收率分别为91%、93%、109.7%，回收率在90%-110%之间。平均回收率为97.9%。
2.3.3方法学精密度
表4.样品的精密度试验
P4（ng/mL） 批内误差 批间误差
平均结合率（%）±标准差 平均结合率（%）±标准差(变异系数CV%)
10 32.87 ±0.97 61.58 ±9.49 (15.41)
5 41.62 ±1.10 70.52 ±9.76 (13.84)
2 57.52 ±4.25 78.71 ±8.05 (10.23)
1 66.73 ±3.02 82.76 ±5.23 (6.31)
0.5 75.98 ±3.38 86.32 ±4.64 (5.37)
0.2 83.08 ±2.93 90.14 ±4.96 (5.50)
0.1 87.89 ±1.63 93.29 ±4.65 (4.99)
0.05 92.08±2.81 96.01 ±1.95 (2.03)
平均值 67.22±2.51批内变异： 3.73% 批间总变异：7.96%
本试验，批内差异以标准曲线的批内变异系数（CV）表示，CV%=SD均值/平均结合率均值×100%=2.51/67.22×100%=3.73%，批间总变异为7.96%。
2.3.4方法学特异性
表5.样品的特异性试验
竞争物种类 交叉反应率（%）
雌二醇 <0.01%
雌三醇 <0.01%
雌酮 <0.01%
睾酮 0.35%
由上表5可以看出，用50%置换法测得孕酮抗体与雌二醇、雌三醇、雌酮交叉反应率均小于0.01% ，与睾酮交叉反应率为0.35%。
2.4母猪粪样中孕酮浓度测定
图2.母猪粪便中孕酮浓度分布
用本试验建立的方法测定粪样中孕酮含量，母猪的早期妊娠诊断以粪样中200ng/g的孕酮浓度为标准进行判定，当配种后母猪粪样中孕酮的含量超过200ng/g粪样时，就可确认其妊娠；小于200ng/g粪样时，可初步确认其空怀。
表6.ELISA诊断的妊娠与空怀试验
配种后的天数（配种当天为第0天） 空怀 总数
21 22 23 24 25
检查的母猪头数 18 21 23 22 18 20 122
通过ELISA诊断的妊娠数 16 21 23 21 17 98
通过ELISA诊断的空怀数 16
ELISA诊断妊娠的准确率(％) 88.9 100 100 95.5 94.4 96.1
ELISA诊断空怀的准确率(％) 80
由所测结果可知，依据粪样中的孕酮含量进行早期妊娠诊断，诊断妊娠的准确率达98/102= 96.1%，诊断空怀的准确率达16/20=80%。
3.讨论
母畜的粪或血液中的孕酮的含量变化是卵巢上黄体发育的结果，是母畜卵巢功能的体现，母畜周期性发情的实质是卵巢上卵泡与黄体的交替发育，反映到粪便中是雌二醇与孕酮含量的周期性变化，在发情期，由于卵巢上黄体退化、卵泡发育，粪中孕酮含量很低，而雌二醇含量较高；如果母畜发情输精后受精、妊娠，则发情后形成的周期黄体不再被子宫内膜分泌的前列腺素所溶解退化，周期性发情终止，形成妊娠黄体，在下个发情期到来的时间内，粪中的孕酮含量维持在较高水平。另外，Hulten等报告称通过测定血浆孕酮进行早期妊娠诊断测定时间是从配种后19天到23天，由于相对于血液中的孕酮含量，在粪便中的孕酮含度的变化有约2天的延迟。因此本试验以配种后第21-25d母猪的粪便作为检测对象，粪样中200ng/g的孕酮浓度为标准进行判定，当配种后母猪粪样中孕酮的含量大于200ng/g 粪样时，就可确认其妊娠；小于200ng/g粪样时，可初步确认其空怀。该结果与Masaharu 等(2010)的研究结果基本相似。
本试验成功得建立了母猪粪便孕酮酶免法，在试验过程中得到的标准曲线标准曲线采用了E/E0-lnC的数学模型可以定量测定出样品中孕酮的含量。对粪样孕酮酶免法测定灵敏度为12.13ng/g；平均回收率为97.9%，板内和板间变异系数分别为3.73%和7.96%，用50%置换法测得孕酮抗体与雌二醇、雌三醇、雌酮交叉反应率均小于0.01%，与睾酮交叉反应率为0.35%。
与采集血样相比，母猪粪便孕酮酶免法具有采样方便，操作简单，无需使用微量取液器等优点，可用于母猪发情检查、妊娠诊断等。
致谢
特别感谢大学动物繁殖研究室的冯建刚师兄在我实验进展、论文撰写和生活等方面给予的关心和无私的帮助。
最后,感谢我的家人和所有亲人朋友对我多年求学道路上给予的物质和精神上的支持与鼓励,正是他们的支持与鼓励才使我能够不断战胜困难,顺利完成学业。
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摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1主要仪器设备2
1.1.2试验药品及试剂 2
1.1.3要配置的溶液 2
1.1.4粪便收集和粪便溶液的制备2
1.2方法 2
1.2.1 ELISA的反应原理和流程2
1.2.2孕酮抗体最佳包被浓度和酶标孕酮工作浓度的选择2
1.2.3标准曲线的制作2
1.2.4方法学鉴定3
1.2.5母猪早期妊娠诊断
2结果与分析3
2.1选择孕酮抗体最佳包被浓度和酶标孕酮工作浓度3
2.2测定粪样孕酮酶联免疫法的建立3
2.3方法学鉴定4
2.3.1方法学灵敏度4
2.3.2方法学准确度4
2.3.3方法学精密度4
2.3.4方法学特异性5
2.4母猪粪样中孕酮浓度测定5
3讨论6
致谢6
参考文献7
粪便孕酮酶免测定法在母猪早期妊娠诊断中的研究
引言
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