褪黑素对呕吐毒素侵害的卵母细胞的挽救作用
呕吐毒素在粮谷类原料，例如小麦、燕麦、玉米、大麦等中污染情况普遍。人类误食呕吐毒素污染的粮食会引起免疫抑制，贫血，头痛，呕吐，厌食和腹痛等症状。然而，关于呕吐毒素对哺乳动物卵子质量的影响还不清楚。本实验旨在探讨呕吐毒素对卵母细胞成熟的影响，分析褪黑素对呕吐毒素侵害的卵母细胞成熟的影响。实验结果显示呕吐毒素显著抑制卵母细胞成熟。具体表现为卵母细胞成熟率下降，减数分裂纺锤体组装异常，氧化应激水平升高，表观遗传修饰受到影响。结果表明呕吐毒素影响卵母细胞的成熟，而褪黑素能够改善呕吐毒素侵害的卵母细胞的成熟。深入探索发现褪黑素能减缓呕吐毒素使卵母细胞氧化应激水平升高的状态。综合起来，实验结果表明呕吐毒素能够使卵母细胞质量下降，褪黑素能够通过改善卵母细胞的氧化应激使卵母细胞成熟。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
绪论 1
1材料与方法2
1.1抗体和化学品2
1.2卵母细胞的采集与体外成熟技术2
1.3呕吐毒素和褪黑素的处理2
1.4免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜3
1.5统计分析3
2 结果与分析3
2.1褪黑素能够提高DON处理的卵母细胞的成熟率 3
2.2褪黑素能够改善DON处理的卵母细胞中的纺锤体缺陷4
2.3褪黑素可以挽救DON处理的卵母细胞的表观遗传改变 5
2.4褪黑素可以缓解DON处理的卵母细胞中的氧化应激 5
3 讨论 6
致谢7
参考文献7
褪黑素对呕吐毒素侵害的卵母细胞的挽救作用
引言
绪论
Yoshizawa等 [1]从污染的玉米中分离得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，并根据它能引发母猪拒食和呕吐的特征，将其定名为呕吐毒素(Vomitoxin，VT)。DON主要由禾谷镰刀菌(Fusarium．graminearum)和黄色镰刀菌(F．culmo— rum)产生 [2]，该两株菌是引起小麦赤霉病和玉米穗腐病的病原菌 [3]。该毒素在粮谷类原料中污染情况非常普遍，是污 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
染小麦、燕麦、玉米、大麦等粮食（饲料）及其制品的最广泛、最常见真菌毒素。家畜食用呕吐毒素污染的饲料会引起拒食，呕吐，生长延迟，生殖紊乱等症状；而人类误食呕吐毒素污染的粮食会引起免疫抑制，贫血，头痛，呕吐，厌食和腹痛等症状 [45]。
目前，有很多关于呕吐毒素对于生产性能、消化系统、免疫系统等方面的研究，但是关于呕吐毒素对生殖方面的研究较少，呕吐毒素对卵子质量的影响更是未知。
褪黑素(melatonin, MT)又名美拉酮宁、抑黑素、松果腺素 [6]。MT主要是由松果体腺细胞从血液中摄取色氨酸及其羟化酶经过复杂的生化反应逐步合成的 [7]。以色氨酸为原料，经过羟化，脱羧，N乙酰化和氧甲基化，最终形成褪黑素 [8]。自20世纪90年代以来，人们陆续从多种植物中检测出MT，这些外源性MT到达动物或人体内，具有同样的生理活性 [910]。研究表明，褪黑素可以调控动物下丘脑－垂体－性腺轴生殖相关激素的内分泌作用，抑制或促进促性腺激素释放激素（GnRH）、促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、性腺激素的分泌 [11]。Wurtman R J等 [12]报道外源性褪黑素可降低雌性大鼠卵巢的重量。
褪黑素(MT)具有抗氧化活性,是一种高效自由基清除剂。从抗氧化的化学机制方面看,MT为高选择性电子供体,不易发生氧化还原循环反应,也无促氧化副作用。从抗氧化的生物学机制方面看,MT通过保护生物大分子,抑制细胞凋亡和诱导抗氧化防御酶发挥抗氧化效应。体内外动物实验表明 ,MT对神经性疾病、环境化合物的靶器官毒性、自发性和诱发性肿瘤、糖尿病和胚胎发育异常等自由基损伤性疾病都有不同程度的保护作用 [13]。
有研究表明，抗氧化作用是褪黑素发挥挽救作用的重要途径之一。褪黑素能够清除羟基、碳酸脂、多种有机基团，以及ROS，同时也能够通过促进抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽还原酶等的合成来增强细胞抗氧化性;褪黑素还能够保持线粒体的动态平衡，减少自由基的合成，以及保护线粒体ATP的合成 [14]。MT 还可抑制体内NO合成酶的活性，从而抑制NO的生成以减少其对机体的氧化损伤 [15]。褪黑素能够改善MEHP诱导的卵母细胞的氧化应激水平 [16]。
但是在卵母细胞中，褪黑素是否能够通过降低氧化应激水平，以及影响线粒体分布和代谢活性等来挽救呕吐毒素侵害的卵母细胞这方面的研究还是很少。
本实验采用小鼠卵母细胞作为模型，研究呕吐毒素对卵母细胞的毒性作用，并分析褪黑素对呕吐毒素侵害的卵母细胞成熟的影响。实验结果表明呕吐毒素对卵母细胞的成熟有不利影响，但是褪黑素能够，恢复卵母细胞中的纺锤体缺陷，挽救卵母细胞的表观遗传改变，缓解卵母细胞中的氧化应激，最终提高呕吐毒素侵害的卵母细胞的成熟率。
1 材料与方法
抗体和化学药品
实验使用的化学药品呕吐毒素、褪黑素购自百灵威科技，Sigma M2培养液、小鼠抗α微管蛋白FITC单克隆抗体、鬼笔环肽TRITC和Hoechst3334均购自Sigma Chemical公司。5mC单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司。
卵母细胞的采集与体外成熟技术
小鼠卵巢的采集：将雌鼠采用颈椎脱臼法处死，将获得的卵巢放入含有0.9%生理盐水的培养皿中，切碎获取卵泡液和卵丘卵母细胞复合体（COCS），选择具有完整紧凑的卵丘细胞和均匀卵原的卵母细胞用于研究。
小鼠卵母细胞的培养：采用Sigma M2培养液体外培养卵母细胞89小时至MI期，体外培养卵母细胞12小时到MII期。一组50个卵母细胞置于含有50μl培养液，覆盖20μl石蜡油的35mm培养皿（Nunc，Roskilde，丹麦）中，在37℃，5％CO2的湿润气氛中培养。
呕吐毒素和褪黑素的处理
COCs被分为一下三组：
未处理COCs组（对照）；
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
绪论 1
1材料与方法2
1.1抗体和化学品2
1.2卵母细胞的采集与体外成熟技术2
1.3呕吐毒素和褪黑素的处理2
1.4免疫荧光染色和激光共聚焦显微镜3
1.5统计分析3
2 结果与分析3
2.1褪黑素能够提高DON处理的卵母细胞的成熟率 3
2.2褪黑素能够改善DON处理的卵母细胞中的纺锤体缺陷4
2.3褪黑素可以挽救DON处理的卵母细胞的表观遗传改变 5
2.4褪黑素可以缓解DON处理的卵母细胞中的氧化应激 5
3 讨论 6
致谢7
参考文献7
褪黑素对呕吐毒素侵害的卵母细胞的挽救作用
引言
绪论
Yoshizawa等 [1]从污染的玉米中分离得到脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)，并根据它能引发母猪拒食和呕吐的特征，将其定名为呕吐毒素(Vomitoxin，VT)。DON主要由禾谷镰刀菌(Fusarium．graminearum)和黄色镰刀菌(F．culmo— rum)产生 [2]，该两株菌是引起小麦赤霉病和玉米穗腐病的病原菌 [3]。该毒素在粮谷类原料中污染情况非常普遍，是污 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
染小麦、燕麦、玉米、大麦等粮食（饲料）及其制品的最广泛、最常见真菌毒素。家畜食用呕吐毒素污染的饲料会引起拒食，呕吐，生长延迟，生殖紊乱等症状；而人类误食呕吐毒素污染的粮食会引起免疫抑制，贫血，头痛，呕吐，厌食和腹痛等症状 [45]。
目前，有很多关于呕吐毒素对于生产性能、消化系统、免疫系统等方面的研究，但是关于呕吐毒素对生殖方面的研究较少，呕吐毒素对卵子质量的影响更是未知。
褪黑素(melatonin, MT)又名美拉酮宁、抑黑素、松果腺素 [6]。MT主要是由松果体腺细胞从血液中摄取色氨酸及其羟化酶经过复杂的生化反应逐步合成的 [7]。以色氨酸为原料，经过羟化，脱羧，N乙酰化和氧甲基化，最终形成褪黑素 [8]。自20世纪90年代以来，人们陆续从多种植物中检测出MT，这些外源性MT到达动物或人体内，具有同样的生理活性 [910]。研究表明，褪黑素可以调控动物下丘脑－垂体－性腺轴生殖相关激素的内分泌作用，抑制或促进促性腺激素释放激素（GnRH）、促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、性腺激素的分泌 [11]。Wurtman R J等 [12]报道外源性褪黑素可降低雌性大鼠卵巢的重量。
褪黑素(MT)具有抗氧化活性,是一种高效自由基清除剂。从抗氧化的化学机制方面看,MT为高选择性电子供体,不易发生氧化还原循环反应,也无促氧化副作用。从抗氧化的生物学机制方面看,MT通过保护生物大分子,抑制细胞凋亡和诱导抗氧化防御酶发挥抗氧化效应。体内外动物实验表明 ,MT对神经性疾病、环境化合物的靶器官毒性、自发性和诱发性肿瘤、糖尿病和胚胎发育异常等自由基损伤性疾病都有不同程度的保护作用 [13]。
有研究表明，抗氧化作用是褪黑素发挥挽救作用的重要途径之一。褪黑素能够清除羟基、碳酸脂、多种有机基团，以及ROS，同时也能够通过促进抗氧化酶，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽转移酶、谷胱甘肽还原酶等的合成来增强细胞抗氧化性;褪黑素还能够保持线粒体的动态平衡，减少自由基的合成，以及保护线粒体ATP的合成 [14]。MT 还可抑制体内NO合成酶的活性，从而抑制NO的生成以减少其对机体的氧化损伤 [15]。褪黑素能够改善MEHP诱导的卵母细胞的氧化应激水平 [16]。
但是在卵母细胞中，褪黑素是否能够通过降低氧化应激水平，以及影响线粒体分布和代谢活性等来挽救呕吐毒素侵害的卵母细胞这方面的研究还是很少。
本实验采用小鼠卵母细胞作为模型，研究呕吐毒素对卵母细胞的毒性作用，并分析褪黑素对呕吐毒素侵害的卵母细胞成熟的影响。实验结果表明呕吐毒素对卵母细胞的成熟有不利影响，但是褪黑素能够，恢复卵母细胞中的纺锤体缺陷，挽救卵母细胞的表观遗传改变，缓解卵母细胞中的氧化应激，最终提高呕吐毒素侵害的卵母细胞的成熟率。
1 材料与方法
抗体和化学药品
实验使用的化学药品呕吐毒素、褪黑素购自百灵威科技，Sigma M2培养液、小鼠抗α微管蛋白FITC单克隆抗体、鬼笔环肽TRITC和Hoechst3334均购自Sigma Chemical公司。5mC单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司。
卵母细胞的采集与体外成熟技术
小鼠卵巢的采集：将雌鼠采用颈椎脱臼法处死，将获得的卵巢放入含有0.9%生理盐水的培养皿中，切碎获取卵泡液和卵丘卵母细胞复合体（COCS），选择具有完整紧凑的卵丘细胞和均匀卵原的卵母细胞用于研究。
小鼠卵母细胞的培养：采用Sigma M2培养液体外培养卵母细胞89小时至MI期，体外培养卵母细胞12小时到MII期。一组50个卵母细胞置于含有50μl培养液，覆盖20μl石蜡油的35mm培养皿（Nunc，Roskilde，丹麦）中，在37℃，5％CO2的湿润气氛中培养。
呕吐毒素和褪黑素的处理
COCs被分为一下三组：
未处理COCs组（对照）；
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