牛病毒性腹泻黏膜病病毒ah2016株的分离与鉴定牛病毒性腹泻黏膜病病毒ah2016株的分离与鉴定(附件)【字数：7350】
1牛病毒性腹泻-黏膜病病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，BVDV）可简称为牛病毒性腹泻病毒或牛黏膜病病毒，是黄病毒科瘟病毒属的成员。BVDV是牛病毒性腹泻-黏膜病（BVD-MD）的病原，感染患畜表现出的症状为急慢性腹泻及黏膜病，除此之外亚临床感染表现出免疫耐受，孕畜则会出现流产、死胎等症状。由于牛病毒性腹泻-黏膜病的感染率及死亡率都极高，对养殖业危害严重。目前欧美国家通过严格的检测及净化使本病得到控制，而我国该病仍广泛存在。本实验于安徽某牛场疑似BVDV感染牛临床组织病料（脾、淋巴结、心肌、血液等）中分离得到疑似BVDV毒株，接种MDBK细胞后出现典型细胞病变。通过RT-PCR技术扩增了临床分离毒株的部分基因序列，并克隆至pEASY-Blunt Simple载体中，进行测序及序列分析。研究成功扩增该毒株部分基因，命名为A2与B1。测序结果显示该疑似BVDV毒株与标准毒株NADL序列同源性75%，证明分离毒株为BVDV毒株，命名为BVDV AH2016。
目 录
Abstract1
Key Words 1
引言1
材料与方法3
1.1实验材料3
1.1.1质粒3
1.1.2病毒与细胞3
1.1.3主要试剂3
1.2 BVDV AH2016株的分离与增殖3
1.2.1 疑似BVDV的分离3
1.2.2 MDBK细胞的传代3
1.2.3 BVDV病毒增殖3
1.3 BVDV AH2016部分基因序列的扩增4
1.3.1引物设计4
1.3.2 BVDV基因组RNA的提取4
1.3.3反转录合成cDNA4
1.3.4 PCR产物克隆与转化5
1.3.5重组质粒阳性克隆的筛选与鉴定5
1.3.6序列测定6
2.结果与分析6
2.1 疑似BVDV毒株的分离6
2.2 BVDV AH2016部分基因序列分析6
2.3 A2序列测定6
2.4 B1序列测定7
2.5影响实 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
验成功的因素8
2.5.1片段大小对于实验的影响8
2.5.2载体的选择对实验的影响9
2.5.3引物设计对实验的影响9
3讨论9
致谢9
参考文献9
牛病毒性腹泻黏膜病病毒AH2016株的分离与鉴定
动物医学专业学生 李德昭
指导老师 钱莺娟
Isolation and identification of bovine viral diarrhea
and mucosa disease AH2016 strain virus
Student majoring inVeterinary medicine LI Dezhao
Tutor QIAN Yingjuan
Abstract：Bovine viral diarrheamucosal disease virus（BVDV）can be referred to the member of the pestivirus genus，family Flaviviridea . BVDV causes Bovine viral diarrheamucosal disease（BVDMD）.Bovine infected by BVDV showed diarrhea，acute and chronic mucosal disease, as well as subclinical symptoms, including immune tolerance, abortion, and dead fetus. Due to the high rate of infection and mortality, it causes great impact on breeding industry around the world. At present,this disease is effectively controlled in the European and North America through strict detection and purification, but BVDV is still prevalent in China. In this study, we have isolated a suspected BVDV strain from clinical tissue sample from Anhui. The sample was inoculated to MDBK cells, then the CPE caused by the suspected virus was observed. we also have amplified parts of the strain genome, named A2 and B1. The sequencing result shows it’s 75% matching between the isolated strain and classical strain NADL. It indicated that the isolated strain was BVDV and named BVDV AH2016.
Key words： BVDV AH2016 strain；Isolation; Identification
牛病毒性腹泻黏膜病病毒（Bovine viral diarrheamucosal disease virus，BVDV）是牛病毒性腹泻黏膜病（BVDMD）的病原，属于黄病毒科瘟病毒属。患畜的临床症状主要为腹泻及黏膜病，亚临床感染症状为持续性感染及免疫耐受，孕畜患病后发生流产或产下死胎、畸形胎或持续性感染胎儿。BVDV主要感染反刍兽，猪在感染病毒后呈现亚临床症状[1]。
牛病毒性腹泻黏膜病在世界范围内广泛存在，而其引发的临床症状影响到生产的每个环节，如产奶量下降、生长迟缓、繁殖能力下降、继发感染等，因此对养殖业，尤其是养牛业造成极大损害。近年来在欧美各国，养殖者通过严格的检验检疫措施和彻底的净化法对该病进行了限制，并获得了较为良好的成效，而在我国该病仍广泛流行，在20多个省市均有报道。
该病最早在1946年美国纽约由Olafson等人在病毒性腹泻牛群中发现，1957年BVDV病毒首次被分离出来。Gillespie等人在三年后分离到BVDV C24V标准毒株用于该病的血清学及病毒学研究。牛病毒性腹泻黏膜病在1971年由美国兽医协会统一命名。我国最早在1980分离出BVDV病毒。1996年第一次完成了含有BVDV全长基因组的cDNA克隆[2,3,4]。
目 录
Abstract1
Key Words 1
引言1
材料与方法3
1.1实验材料3
1.1.1质粒3
1.1.2病毒与细胞3
1.1.3主要试剂3
1.2 BVDV AH2016株的分离与增殖3
1.2.1 疑似BVDV的分离3
1.2.2 MDBK细胞的传代3
1.2.3 BVDV病毒增殖3
1.3 BVDV AH2016部分基因序列的扩增4
1.3.1引物设计4
1.3.2 BVDV基因组RNA的提取4
1.3.3反转录合成cDNA4
1.3.4 PCR产物克隆与转化5
1.3.5重组质粒阳性克隆的筛选与鉴定5
1.3.6序列测定6
2.结果与分析6
2.1 疑似BVDV毒株的分离6
2.2 BVDV AH2016部分基因序列分析6
2.3 A2序列测定6
2.4 B1序列测定7
2.5影响实 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: *351916072*
验成功的因素8
2.5.1片段大小对于实验的影响8
2.5.2载体的选择对实验的影响9
2.5.3引物设计对实验的影响9
3讨论9
致谢9
参考文献9
牛病毒性腹泻黏膜病病毒AH2016株的分离与鉴定
动物医学专业学生 李德昭
指导老师 钱莺娟
Isolation and identification of bovine viral diarrhea
and mucosa disease AH2016 strain virus
Student majoring inVeterinary medicine LI Dezhao
Tutor QIAN Yingjuan
Abstract：Bovine viral diarrheamucosal disease virus（BVDV）can be referred to the member of the pestivirus genus，family Flaviviridea . BVDV causes Bovine viral diarrheamucosal disease（BVDMD）.Bovine infected by BVDV showed diarrhea，acute and chronic mucosal disease, as well as subclinical symptoms, including immune tolerance, abortion, and dead fetus. Due to the high rate of infection and mortality, it causes great impact on breeding industry around the world. At present,this disease is effectively controlled in the European and North America through strict detection and purification, but BVDV is still prevalent in China. In this study, we have isolated a suspected BVDV strain from clinical tissue sample from Anhui. The sample was inoculated to MDBK cells, then the CPE caused by the suspected virus was observed. we also have amplified parts of the strain genome, named A2 and B1. The sequencing result shows it’s 75% matching between the isolated strain and classical strain NADL. It indicated that the isolated strain was BVDV and named BVDV AH2016.
Key words： BVDV AH2016 strain；Isolation; Identification
牛病毒性腹泻黏膜病病毒（Bovine viral diarrheamucosal disease virus，BVDV）是牛病毒性腹泻黏膜病（BVDMD）的病原，属于黄病毒科瘟病毒属。患畜的临床症状主要为腹泻及黏膜病，亚临床感染症状为持续性感染及免疫耐受，孕畜患病后发生流产或产下死胎、畸形胎或持续性感染胎儿。BVDV主要感染反刍兽，猪在感染病毒后呈现亚临床症状[1]。
牛病毒性腹泻黏膜病在世界范围内广泛存在，而其引发的临床症状影响到生产的每个环节，如产奶量下降、生长迟缓、繁殖能力下降、继发感染等，因此对养殖业，尤其是养牛业造成极大损害。近年来在欧美各国，养殖者通过严格的检验检疫措施和彻底的净化法对该病进行了限制，并获得了较为良好的成效，而在我国该病仍广泛流行，在20多个省市均有报道。
该病最早在1946年美国纽约由Olafson等人在病毒性腹泻牛群中发现，1957年BVDV病毒首次被分离出来。Gillespie等人在三年后分离到BVDV C24V标准毒株用于该病的血清学及病毒学研究。牛病毒性腹泻黏膜病在1971年由美国兽医协会统一命名。我国最早在1980分离出BVDV病毒。1996年第一次完成了含有BVDV全长基因组的cDNA克隆[2,3,4]。
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