pmrb插入突变介导大肠杆菌对多粘菌素e耐药的机制
大肠杆菌多药耐药、泛耐药菌株的出现已经成为了当今医学临床治疗的难题，多粘菌素俨然成为最后的药物选择，但不可避免的在临床上已经产生了多粘菌素耐药株，使大肠杆菌病的治疗面临巨大的阻碍。阐明大肠杆菌对多粘菌素的耐药机制对延缓细菌耐药性产生及寻找新的药物靶位均具有重要意义。目前本实验室发现1株体外诱导的多粘菌素耐药菌株二元调控系统的pmrB基因在229位插入了一段30 bp的序列，这个序列位于两个AGCCTG之间并复制了pmrB中HAMP结构域序列，为验证该插入突变是否参与多粘菌素耐药性产生，本实验通过Red同源重组的方法分别敲除pmrA和pmrB的插入序列，然后采用微量肉汤稀释法检测多粘菌素E对pmrA基因缺失株和pmrB回复突变株的MIC。结果显示，Red同源重组方法可用于敲除pmrA和pmrB的插入片段，通过基因测序验证本实验成功建立了pmrA基因缺失株和pmrB基因的回复突变株，MIC结果验证pmrA基因缺失株和pmrB基因回复突变菌株对多粘菌素E的敏感性恢复，MIC由原来耐药菌的256 μg·ml-1均降至1 μg·ml-1。证实大肠杆菌的二元调控系统的pmrB基因的插入突变会导致大肠杆菌对多粘菌素E耐药。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1菌株2
1.1.2药物储备液及相关试剂配制3
1.1.3培养基及其配制3
1.1.4主要仪器和试剂 3
1.2方法 3
1.2.1 大肠杆菌91R MIC的测定3
1.2.2 red同源重组4
1.2.3 大肠杆菌91R△pmrA、91R△IS MIC的测定5
2结果与分析5
2.1 91R pmrA缺失株的构建及鉴定5
2.2 91R回复突变株的构建及鉴定6
2.3缺失株及回复突变株最低抑菌浓度测定7
3讨论7
致谢9
参考文献9
pmrB插入突变介导大肠杆菌对多粘菌素E耐药的机制
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
大肠杆菌是大肠埃希菌的俗称，在自然界中大肠杆菌的种类有很多，但大多数均没有致病性，并且发挥维持肠道的生理功能的作用。不过仍存在某些致病性大肠杆菌可引起动物的泌尿道的感染、腹泻、家禽的卵黄性腹膜炎等[1]，对人类和动物的健康均产生了严重的危害。
多粘菌素是一种古老的抗生素，包括五种成分（多粘菌素A、B、C、D、E），现应用于临床的是多粘菌素B和E，其灭菌机制[22]主要是通过与革兰氏阴性菌细胞膜LPS结合，破坏其通透性，将其杀死，但由于其严重的毒性作用而未被广泛的应用[23]。近年来，由于多药耐药、泛耐药大肠杆菌的感染流行，多粘菌素俨然成为最后的药物选择[7]，但是伴随多粘菌素的逐步应用，不可避免的出现了多粘菌素类药物耐药的菌株。
基因敲除是研究基因功能最常用的方法，对比缺失前后的表型差异，从而推测基因在细菌生长繁殖及致病中的作用[24]。不同细菌中，利用基因敲除方法和相应质粒载体均不相同，由于某些敲除方法概率小，操作复杂，使得基因缺失概率大大减小从而影响对于功能基因的深入研究。
基于以上工作基础，本实验以实验室已有的多粘菌素类体外诱导耐药的大肠杆菌耐药菌株为研究对象，借鉴Wanner的方案采用red同源重组方法，即利用PKD3 、PKD46、 PCP20三个质粒构建pmrA缺失株及pmrB基因插入突变的回复突变株[25,26]，通过检测耐药表型的变化，最终明确pmrB基因的插入突变对菌株多粘菌素耐药性产生的作用，为延缓细菌耐药性产生和发掘新的药物靶位提供探索途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒
本实验所采用的大肠杆菌敏感菌91株是于2014年分离于江苏发病鸭场；耐药菌株91R即由敏感菌91体外经多粘菌素E诱导而得的多粘菌素高度耐药菌株。构建回复突变株所用质粒包括PKD3、PKD46、PCP20均由大学微生物实验室馈赠（表1）。
表1 本试验中所用质粒
Table 1 Plasmid used in this study
质粒
Plasmid
特征
Characteristic
PKD46
氨苄抗性，表达red同源重组蛋白
PKD3
氯霉素抗性，质粒模板
PCP20
氯霉素和氨苄抗性，表达FLP翻转酶
1.1.2 药物储备液及相关试剂配制
多粘菌素E (Polymyxin E)购自美国Amresco公司，药物储备液浓度为2 560 μg/mL，药物储备液均需要以一次性滤器（0.22 μm）滤过除菌后分装保存于20 ℃。
1.1.3 培养基及其配制
LB液体培养基：取25 g培养基溶于1000ml蒸馏水中，并将pH调节至7.2～7.4。MH肉汤培养基：取MH肉汤18 g于1000ml蒸馏水中，并调节pH至7.2～7.4。固体培养基需要另外加入琼脂（1.5%），培养基均购自南京寿德有限公司。
1.1.4 主要仪器和试剂
1.1.4.1 仪器设备
0.1 cm电击杯购自美国伯乐（Biorad）公司；Biorad电转化仪Gene Pulser Xcell电转系统；AIRTECH超净工作台；恒温培养箱（上海森信公司）；高压灭菌锅；恒温空气摇床；Sigma高速冷冻离心机；Thermo紫外分光光度计；琼脂糖凝胶电泳仪；Sartorius电子称； Haier4 ℃冰箱；20 ℃冷冻冰箱；96孔聚苯乙烯板
1.1.4.2 试剂
2×Prime STAR GXL DNA Polymerse Mix、DL2000marker购自大连TaKaRa公司，L阿拉伯糖为鼎国生物公司产品，LB肉汤培养基购自寿德有限公司，AXYGEN胶回收试剂盒为钟鼎生物试剂公司产品
加药培养基中抗生素剂量：氯霉素（Chloramphenicol，Cm）25 μg/mL、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)100 μg/mL。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌91R MIC的测定
利用微量肉汤稀释法（美国临床检验标准委员会（CLSI）[13]推荐）测定大肠杆菌91R菌株对多粘菌素E的最小抑菌浓度，并参照EUCAST[14]规定的耐药性折点来分析菌株的耐药性。
1.2.1.1 菌悬液的制备
将大肠杆菌91R冻存液划线，37 ℃在LB平板上培养过夜，然后挑取线上的单菌落于LB肉汤中增菌培养，于180 rmin1摇床在37 ℃震荡培养至对数生长的末期，最后利用MH培养基将菌液调至0.5个麦氏浊度单位。
1.2.1.2 微量肉汤稀释法测定MIC
96孔板泡酸后用酒精棉消毒，放在超净台中照紫外过夜备用。将上述稀释后的菌悬液按照第一孔加180 μL，剩下每孔100 μL，12孔加入培养基，作为空白对照，加入96孔板。然后第一孔加入20 μL多粘菌素E药物储备液，依次倍比稀释至第10孔，第11孔为阳性对照，需要两组平行试验。37℃过夜培养，24h后结果观察。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言2
1材料与方法2
1.1材料 2
1.1.1菌株2
1.1.2药物储备液及相关试剂配制3
1.1.3培养基及其配制3
1.1.4主要仪器和试剂 3
1.2方法 3
1.2.1 大肠杆菌91R MIC的测定3
1.2.2 red同源重组4
1.2.3 大肠杆菌91R△pmrA、91R△IS MIC的测定5
2结果与分析5
2.1 91R pmrA缺失株的构建及鉴定5
2.2 91R回复突变株的构建及鉴定6
2.3缺失株及回复突变株最低抑菌浓度测定7
3讨论7
致谢9
参考文献9
pmrB插入突变介导大肠杆菌对多粘菌素E耐药的机制
引言
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: #351916072#
大肠杆菌是大肠埃希菌的俗称，在自然界中大肠杆菌的种类有很多，但大多数均没有致病性，并且发挥维持肠道的生理功能的作用。不过仍存在某些致病性大肠杆菌可引起动物的泌尿道的感染、腹泻、家禽的卵黄性腹膜炎等[1]，对人类和动物的健康均产生了严重的危害。
多粘菌素是一种古老的抗生素，包括五种成分（多粘菌素A、B、C、D、E），现应用于临床的是多粘菌素B和E，其灭菌机制[22]主要是通过与革兰氏阴性菌细胞膜LPS结合，破坏其通透性，将其杀死，但由于其严重的毒性作用而未被广泛的应用[23]。近年来，由于多药耐药、泛耐药大肠杆菌的感染流行，多粘菌素俨然成为最后的药物选择[7]，但是伴随多粘菌素的逐步应用，不可避免的出现了多粘菌素类药物耐药的菌株。
基因敲除是研究基因功能最常用的方法，对比缺失前后的表型差异，从而推测基因在细菌生长繁殖及致病中的作用[24]。不同细菌中，利用基因敲除方法和相应质粒载体均不相同，由于某些敲除方法概率小，操作复杂，使得基因缺失概率大大减小从而影响对于功能基因的深入研究。
基于以上工作基础，本实验以实验室已有的多粘菌素类体外诱导耐药的大肠杆菌耐药菌株为研究对象，借鉴Wanner的方案采用red同源重组方法，即利用PKD3 、PKD46、 PCP20三个质粒构建pmrA缺失株及pmrB基因插入突变的回复突变株[25,26]，通过检测耐药表型的变化，最终明确pmrB基因的插入突变对菌株多粘菌素耐药性产生的作用，为延缓细菌耐药性产生和发掘新的药物靶位提供探索途径。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株及质粒
本实验所采用的大肠杆菌敏感菌91株是于2014年分离于江苏发病鸭场；耐药菌株91R即由敏感菌91体外经多粘菌素E诱导而得的多粘菌素高度耐药菌株。构建回复突变株所用质粒包括PKD3、PKD46、PCP20均由大学微生物实验室馈赠（表1）。
表1 本试验中所用质粒
Table 1 Plasmid used in this study
质粒
Plasmid
特征
Characteristic
PKD46
氨苄抗性，表达red同源重组蛋白
PKD3
氯霉素抗性，质粒模板
PCP20
氯霉素和氨苄抗性，表达FLP翻转酶
1.1.2 药物储备液及相关试剂配制
多粘菌素E (Polymyxin E)购自美国Amresco公司，药物储备液浓度为2 560 μg/mL，药物储备液均需要以一次性滤器（0.22 μm）滤过除菌后分装保存于20 ℃。
1.1.3 培养基及其配制
LB液体培养基：取25 g培养基溶于1000ml蒸馏水中，并将pH调节至7.2～7.4。MH肉汤培养基：取MH肉汤18 g于1000ml蒸馏水中，并调节pH至7.2～7.4。固体培养基需要另外加入琼脂（1.5%），培养基均购自南京寿德有限公司。
1.1.4 主要仪器和试剂
1.1.4.1 仪器设备
0.1 cm电击杯购自美国伯乐（Biorad）公司；Biorad电转化仪Gene Pulser Xcell电转系统；AIRTECH超净工作台；恒温培养箱（上海森信公司）；高压灭菌锅；恒温空气摇床；Sigma高速冷冻离心机；Thermo紫外分光光度计；琼脂糖凝胶电泳仪；Sartorius电子称； Haier4 ℃冰箱；20 ℃冷冻冰箱；96孔聚苯乙烯板
1.1.4.2 试剂
2×Prime STAR GXL DNA Polymerse Mix、DL2000marker购自大连TaKaRa公司，L阿拉伯糖为鼎国生物公司产品，LB肉汤培养基购自寿德有限公司，AXYGEN胶回收试剂盒为钟鼎生物试剂公司产品
加药培养基中抗生素剂量：氯霉素（Chloramphenicol，Cm）25 μg/mL、氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)100 μg/mL。
1.2 方法
1.2.1 大肠杆菌91R MIC的测定
利用微量肉汤稀释法（美国临床检验标准委员会（CLSI）[13]推荐）测定大肠杆菌91R菌株对多粘菌素E的最小抑菌浓度，并参照EUCAST[14]规定的耐药性折点来分析菌株的耐药性。
1.2.1.1 菌悬液的制备
将大肠杆菌91R冻存液划线，37 ℃在LB平板上培养过夜，然后挑取线上的单菌落于LB肉汤中增菌培养，于180 rmin1摇床在37 ℃震荡培养至对数生长的末期，最后利用MH培养基将菌液调至0.5个麦氏浊度单位。
1.2.1.2 微量肉汤稀释法测定MIC
96孔板泡酸后用酒精棉消毒，放在超净台中照紫外过夜备用。将上述稀释后的菌悬液按照第一孔加180 μL，剩下每孔100 μL，12孔加入培养基，作为空白对照，加入96孔板。然后第一孔加入20 μL多粘菌素E药物储备液，依次倍比稀释至第10孔，第11孔为阳性对照，需要两组平行试验。37℃过夜培养，24h后结果观察。
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