规模化猪场中口蹄疫的检测
：口蹄疫是发生于偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，可使世界范围内的畜牧业遭受严重的经济损失，及时、准确地诊断是防治该病的重要环节。根据规模化猪场在生产过程中的实际需求对其送检样品利用酶联免疫吸附反应和荧光RT-PCR技术进行口蹄疫的检测，754份样品进行免疫抗体检测，阳性率79.71%；377份样品进行非结构蛋白检测，阳性率1.59%；169份样品进行抗原检测，结果均呈阴性。此结果有助于规模化养殖场了解疫病的防控情况，为口蹄疫的防控提供参考。
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1□材料与方法2
1.1□检测样品 2
1.2□主要检测试剂 2
1.3□送检样品的处理2
1.3.1□组织样品2
1.3.2□血液样品2
1.4□免疫抗体检测2
1.5□非结构蛋白抗体检测2
1.6□抗原检测2
2□结果与分析2
2.1□免疫抗体检测结果3
2.2□非结构蛋白抗体检测结果4
2.3□口蹄疫抗原检测结果4
3□讨论 4
3.1□口蹄疫检测方法的选取4
3.2□抗体检测5
3.3□抗原检测6
致谢7
参考文献8
表1 口蹄疫免疫抗体检测结果3
表2 口蹄疫非结构蛋白抗体检测结果4
表3 口蹄疫荧光RTPCR检测结果4
规模化猪场中口蹄疫的检测
引言
口蹄疫（footandmouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒(footandmouth disease virus，FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性高度传染性疫病，被国际兽疫局列为A类动物传染病之首[]。由于本病传播途径多、感染性和致病性极强，与一般疫病相比较，感染动物可从多种途径排出病毒，排泄物中有少量病毒存在便可引起易感动物感染，因此该病不仅可通过与感染动物的水疱皮、水疱液、血液、排泄物、体液等直
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
接接触传播，还可通过饲养管理工具、交通运输工具、饲料等间接接触传播[]。规模化猪场饲养数量多且密度高，口蹄疫一旦爆发可能造成巨大损失，因此快速准确地诊断对于口蹄疫的防治至关重要。
检验检疫部门在日常的检测工作中需要对大量样品进行检测，所选方法需具备高敏感性和高特异性，且需准确、快速地得到结果。世界动物卫生组织（OIE）推荐使用病毒中和实验(virus neutralization test，VNT)作为的口蹄疫抗体检测的标准方法，但因其需要使用活病毒，操作需在生物安全等级较高的实验室中进行，且该方法不能区别免疫抗体和野毒抗体[]。本实验室选择酶联免疫吸附反应对规模化养殖场的送检样品进行抗体检测，FMDV疫苗中含有纯化的FMDV结构蛋白，因而经过免疫的动物只会产生针对 FMDV 结构蛋白抗体；但机体感染FMDV后，产生的抗体既有针对结构蛋白的，也有针对非结构蛋白的，因此，针对FMDV非结构蛋白的ELISA不仅能检测野毒感染动物，还可区分免疫动物和野毒感染的动物[]。对有需要进行口蹄疫抗原检测的样品使用荧光RTPCR方法检测，该方法具有操作简便、结果直观等优点。
本实验根据陕西、江苏、安徽、广西等四省份八个规模化猪场的实际需求对其送检样品进行抗原及抗体的检测，所获得的数据可以帮助养殖场了解本场畜群的免疫情况及受到野毒感染的可能性，为其口蹄疫防控情况提供参考，以制订合理的免疫程序及防控措施。
1 材料与方法
1．1 检测样品
分别来自江苏、陕西、广西、安徽等地约八个规模化猪场送检的血液样本及组织样本。
1．2 主要检测试剂
1．2．1 抗体检测所用试剂 PrioCHECK? FMDV type O型口蹄疫病毒O型抗体检测试剂盒、PrioCHECK? FMDV非结构蛋白抗体检测试剂盒均为Prionics公司产品。
1．2．2 抗原检测所用试剂 FMDV荧光RTPCR检测试剂盒为北京生科尚仪科技有限公司产品；氯仿、异丙醇、75%乙醇均为分析纯试剂。
1．3 送检样本的处理
1．3．1 组织样本 取5～10g样本剪碎，加入少量无菌生理盐水，匀浆，取匀浆液约200μL。
1．3．2 血液样本 样本若为全血，将全血充分震荡混匀取1 mL于1.5ml灭菌离心管中，8,000 g离心3分钟，吸取上层血清做ELISA用，残留血清和沉淀充分混匀后取混匀液200μL备用以检测抗原。血凝块按组织样本方式处理；血清样本直接取200μL备用。
1．4 免疫抗体检测
使用 FMDV type O型口蹄疫病毒O型抗体检测试剂盒检测FMDV O型免疫抗体。
1．4．1 操作步骤 取包被灭活的FMDVtype O抗原的酶标板，每孔加入90 μL ELISA缓冲液及阴性对照样本对照原液（2孔）、阳性对照原液（2孔）、参考血清1对照原液（2孔）、参考血清2对照原液（2孔）和已处理的待检血清各10 μL，震荡贴膜，于室温孵育1 h后，使用200~300 μL洗液清洗酶标板6次，最后一次洗毕在吸水纸上拍干酶标板，分别加入现配的酶联结合物溶液100μL，轻轻震荡贴膜，于室温下孵育1 h，使用200~300 μL洗液清洗酶标板6次，最后一次洗毕在吸水纸上拍干酶标板，加可以直接使用的底物100 μL震荡混匀于室温下避光显色15 min后加100 μL终止液终止反应。
1．4．2 读数及结果判定 15 min内在450 nm下读取OD值，在对照成立的前提下，阻断率（percentage inhibition，PI）=≥50％，判定阳性，即为待测血清中含FMDV O型抗体。PI=＜50%，判定为阴性，即为待测血清中不含FMDV O型抗体。PI计算公式：
1．4．3 有效性说明 当结果满足以下几点时，实验有效：OD450阳性对照平均值＜0.350；OD450阴性对照平均值OD450阳性对照平均值 ≥1.000；参考血清1阻断率平均值＞60%；参考血清2阻断率平均值＜40%。
1. 5 非结构蛋白抗体检测
使用FMDVNS抗体检测试剂盒检测非结构蛋白抗体。
1．5．1 操作步骤 取包被活的FMDVNS 抗原的酶标板，每孔加入80 μL ELISA缓冲液及阴性对照样本对照原液（2孔）、阳性对照原液（2孔）、弱阳性对照原液（2孔）和已处理的待检血清各20μL，震荡贴膜，于室温孵育16~18 h后，使用200~300 μL洗液清洗酶标板6次，分别加入现配的酶联结合物溶液100 μL，震荡贴膜，于室温下孵育1 h，使用200~300 μL洗液清洗酶标板6次，最后一次洗毕在吸水纸上拍干酶标板，加可以直接使用的底物100 μL震荡混匀于室温下避光显色20 min后加100 μL终止液终止反应。
1．5．2 读数及结果判定 15 min内在450 nm下读取OD值，在对照成立（OD450阴性对照平均值＞1.000；的前提下，阻断率（percentage inhibition，PI）=≥50％，判定阳性，即为待测血清中含FMDV O型抗体。PI=＜50%，判定为阴性，即为待测血清中不含FMDV O型抗体。PI计算公式：
目录
摘要1
关键词1
Abstract1
Key words1
引言（或绪论）1
1□材料与方法2
1.1□检测样品 2
1.2□主要检测试剂 2
1.3□送检样品的处理2
1.3.1□组织样品2
1.3.2□血液样品2
1.4□免疫抗体检测2
1.5□非结构蛋白抗体检测2
1.6□抗原检测2
2□结果与分析2
2.1□免疫抗体检测结果3
2.2□非结构蛋白抗体检测结果4
2.3□口蹄疫抗原检测结果4
3□讨论 4
3.1□口蹄疫检测方法的选取4
3.2□抗体检测5
3.3□抗原检测6
致谢7
参考文献8
表1 口蹄疫免疫抗体检测结果3
表2 口蹄疫非结构蛋白抗体检测结果4
表3 口蹄疫荧光RTPCR检测结果4
规模化猪场中口蹄疫的检测
引言
口蹄疫（footandmouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒(footandmouth disease virus，FMDV)引起的偶蹄动物的一种急性高度传染性疫病，被国际兽疫局列为A类动物传染病之首[]。由于本病传播途径多、感染性和致病性极强，与一般疫病相比较，感染动物可从多种途径排出病毒，排泄物中有少量病毒存在便可引起易感动物感染，因此该病不仅可通过与感染动物的水疱皮、水疱液、血液、排泄物、体液等直
*好棒文|www.hbsrm.com +Q: ^351916072^
接接触传播，还可通过饲养管理工具、交通运输工具、饲料等间接接触传播[]。规模化猪场饲养数量多且密度高，口蹄疫一旦爆发可能造成巨大损失，因此快速准确地诊断对于口蹄疫的防治至关重要。
检验检疫部门在日常的检测工作中需要对大量样品进行检测，所选方法需具备高敏感性和高特异性，且需准确、快速地得到结果。世界动物卫生组织（OIE）推荐使用病毒中和实验(virus neutralization test，VNT)作为的口蹄疫抗体检测的标准方法，但因其需要使用活病毒，操作需在生物安全等级较高的实验室中进行，且该方法不能区别免疫抗体和野毒抗体[]。本实验室选择酶联免疫吸附反应对规模化养殖场的送检样品进行抗体检测，FMDV疫苗中含有纯化的FMDV结构蛋白，因而经过免疫的动物只会产生针对 FMDV 结构蛋白抗体；但机体感染FMDV后，产生的抗体既有针对结构蛋白的，也有针对非结构蛋白的，因此，针对FMDV非结构蛋白的ELISA不仅能检测野毒感染动物，还可区分免疫动物和野毒感染的动物[]。对有需要进行口蹄疫抗原检测的样品使用荧光RTPCR方法检测，该方法具有操作简便、结果直观等优点。
本实验根据陕西、江苏、安徽、广西等四省份八个规模化猪场的实际需求对其送检样品进行抗原及抗体的检测，所获得的数据可以帮助养殖场了解本场畜群的免疫情况及受到野毒感染的可能性，为其口蹄疫防控情况提供参考，以制订合理的免疫程序及防控措施。
1 材料与方法
1．1 检测样品
分别来自江苏、陕西、广西、安徽等地约八个规模化猪场送检的血液样本及组织样本。
1．2 主要检测试剂
1．2．1 抗体检测所用试剂 PrioCHECK? FMDV type O型口蹄疫病毒O型抗体检测试剂盒、PrioCHECK? FMDV非结构蛋白抗体检测试剂盒均为Prionics公司产品。
1．2．2 抗原检测所用试剂 FMDV荧光RTPCR检测试剂盒为北京生科尚仪科技有限公司产品；氯仿、异丙醇、75%乙醇均为分析纯试剂。
1．3 送检样本的处理
1．3．1 组织样本 取5～10g样本剪碎，加入少量无菌生理盐水，匀浆，取匀浆液约200μL。
1．3．2 血液样本 样本若为全血，将全血充分震荡混匀取1 mL于1.5ml灭菌离心管中，8,000 g离心3分钟，吸取上层血清做ELISA用，残留血清和沉淀充分混匀后取混匀液200μL备用以检测抗原。血凝块按组织样本方式处理；血清样本直接取200μL备用。
1．4 免疫抗体检测
使用 FMDV type O型口蹄疫病毒O型抗体检测试剂盒检测FMDV O型免疫抗体。
1．4．1 操作步骤 取包被灭活的FMDVtype O抗原的酶标板，每孔加入90 μL ELISA缓冲液及阴性对照样本对照原液（2孔）、阳性对照原液（2孔）、参考血清1对照原液（2孔）、参考血清2对照原液（2孔）和已处理的待检血清各10 μL，震荡贴膜，于室温孵育1 h后，使用200~300 μL洗液清洗酶标板6次，最后一次洗毕在吸水纸上拍干酶标板，分别加入现配的酶联结合物溶液100μL，轻轻震荡贴膜，于室温下孵育1 h，使用200~300 μL洗液清洗酶标板6次，最后一次洗毕在吸水纸上拍干酶标板，加可以直接使用的底物100 μL震荡混匀于室温下避光显色15 min后加100 μL终止液终止反应。
1．4．2 读数及结果判定 15 min内在450 nm下读取OD值，在对照成立的前提下，阻断率（percentage inhibition，PI）=≥50％，判定阳性，即为待测血清中含FMDV O型抗体。PI=＜50%，判定为阴性，即为待测血清中不含FMDV O型抗体。PI计算公式：
1．4．3 有效性说明 当结果满足以下几点时，实验有效：OD450阳性对照平均值＜0.350；OD450阴性对照平均值OD450阳性对照平均值 ≥1.000；参考血清1阻断率平均值＞60%；参考血清2阻断率平均值＜40%。
1. 5 非结构蛋白抗体检测
使用FMDVNS抗体检测试剂盒检测非结构蛋白抗体。
1．5．1 操作步骤 取包被活的FMDVNS 抗原的酶标板，每孔加入80 μL ELISA缓冲液及阴性对照样本对照原液（2孔）、阳性对照原液（2孔）、弱阳性对照原液（2孔）和已处理的待检血清各20μL，震荡贴膜，于室温孵育16~18 h后，使用200~300 μL洗液清洗酶标板6次，分别加入现配的酶联结合物溶液100 μL，震荡贴膜，于室温下孵育1 h，使用200~300 μL洗液清洗酶标板6次，最后一次洗毕在吸水纸上拍干酶标板，加可以直接使用的底物100 μL震荡混匀于室温下避光显色20 min后加100 μL终止液终止反应。
1．5．2 读数及结果判定 15 min内在450 nm下读取OD值，在对照成立（OD450阴性对照平均值＞1.000；的前提下，阻断率（percentage inhibition，PI）=≥50％，判定阳性，即为待测血清中含FMDV O型抗体。PI=＜50%，判定为阴性，即为待测血清中不含FMDV O型抗体。PI计算公式：
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