利用激光共聚焦显微镜对米糠和西兰花茎叶粉细胞壁及其消化残渣形态的观察
利用激光共聚焦显微镜(CLSM)对米糠和西兰花茎叶粉原料、由上述原料作为单一纤维来源配制的4种饲粮(分添加/未添加细胞壁降解酶)经生长猪消化后的回肠末端食糜和粪便样品中细胞壁形态、纤维素和木质素分布进行观察，考察米糠和西兰花茎叶粉细胞壁形态和组分在动物消化过程中的变化。结果显示米糠细胞呈不规则立方体，蜂巢状排列；西兰花茎叶细胞呈长方体型，排列相对整齐，体积明显大于米糠细胞。米糠细胞壁中纤维素含量较高，集中在细胞连接处；西兰花茎叶细胞壁中纤维素含量较低，分布比较分散。两原料中均可见少量木质素，分布与纤维素类似。两种原料的回肠末端食糜和粪便样品残渣中均为发现木质素存在的迹象。经猪肠道消化后，两种原料的细胞壁结构完整性均被明显破坏，纤维素含量下降；添加细胞壁降解酶制剂进一步降低了消化残渣中的纤维素含量，相对而言，粪便样品中变化更明显；本试验利用CLSM提供了上述两种纤维性饲料原料细胞壁形态和组分在猪消化过程中变化过程的直观图像，为细胞壁组分的消化代谢研究提供参考。
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论） 3
1材料与方法4
1.1试验材料 4
1.2试验设计 4
1.2.1试验原理4
1.2.2试剂与仪器4
1.2.3纤维素染色方法4
1.2.4 激光共聚焦显微镜参数设定4
2试验结果4
2.1米糠观察结果4
2.2西兰花观察结果7
3分析与讨论10
致谢11
参考文献11
利用激光共聚焦显微镜对米糠和西兰花茎叶粉细胞壁及其消化残渣形态的观察
引言
近年来，饲料原料价格的上涨促使养殖和饲料企业积极寻找价廉物美的替代原料。米糠俗称米皮糠或油糠，是糙米碾白过程中剥离的稻谷内种皮、糊粉层和少量碎米与胚的混合物，营养丰富，常被用作饲料原料。但因其中细胞壁组分含量较高，所以养分的消化率相对较低。我国年产稻谷2.0亿吨以上，按12%出糠率(一般在10%13%之间)计算，米糠年产可达20002500万吨，如提高其养分利用效率，可有效解决缓和饲料资 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
源紧缺的局面[1]。西兰花茎叶粉是利用西兰花花球收获后地上剩余部分经打浆、压滤、烘干和粉碎制成的植物草粉。虽然总纤维高达60~70%，但粗蛋白含量可达22~25%，氨基酸配比平衡；具有浓郁的天然芳香，可改善饲料适口性。随着我国设施农业生产方式的普及和各地蔬菜基地的建设，大量西兰花等蔬菜废弃茎叶集中，已然成为一种可开发利用的非常规饲料原料资源，利用好这一资源不但可以避免粮食供给压力，而且人畜争粮矛盾亦可缓解[2]。
细胞壁是由纤维素和果胶质等多糖和蛋白质及其它成分交联构成的三维网络结构。主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质和木质素等[3]。在米糠和西兰花茎叶粉中，因其细胞壁组分含量较高，导致养分消化率相对较低，所以研究细胞壁组分的消化代谢或许可以成为寻找替代饲料资源的一条新途径。
激光共聚焦显微镜(CLSM)是结合数字图像处理技术和激光光学技术结合而产生的一种高分辨率显微镜，显著不同于其他光学显微技术的是，其并不完全采用光学透镜的成像原理，而是采用扫描激发荧光的方式，对单点上的荧光进行检测再还原成显微图像，与传统光学显微镜相比的优势在于，它的分辨率更高，实现多重荧光同时观察并可形成清晰的三维图像等。所以自它问世已广泛应用于生物学的各个研究领域[4]。本试验利用激光共聚焦显微镜提供了上述两种纤维性饲料原料细胞壁形态和组分在猪消化过程中变化的直观图像，为细胞壁组分的消化代谢研究提供参考。
1 材料与方法
试验材料
本实验所使用的米糠和西兰花茎叶粉原料、由上述原料作为单一纤维来源配制的4种饲粮(分添加/未添加细胞壁降解酶)经生长猪消化后的回肠末端食糜和粪便样品来自于高月琴，张志静等[5]的试验。材料分为：(1)米糠原料(R)、米糠回肠食糜(RL)、米糠加酶回肠食糜样(+RL)、米糠粪便食糜样(RF)、米糠加酶粪便食糜样(+RF)，(2)西兰花原料(B)、西兰花回肠食糜样(BL)、西兰花加酶回肠食糜样(+BL)、西兰花粪便食糜样(BF)、西兰花加酶粪便食糜样(+BF)。
试验设计
1.2.1试验原理
纤维素是植物纤维原料的最主要化学成分，纤维素是由βD葡萄糖基通过1,4糖苷键联结而成的线状高分子化合物[6]。卡尔科弗卢尔荧光增白剂(Calcofluor white,CW)能与β(1→4)及β(1→3)葡聚糖结合对纤维素进行标记，利用CW受364 nm紫外线激发而发出410480 nm蓝色荧光的性质,对细胞壁内β葡聚糖进行定位[7]。
利用木质素是苯基丙烷结构单元(即C6C3单元)中所含芳香性基团能被488nm波长激光激发发射510530 nm绿色荧光[8]，对细胞壁中木质素进行定位[9]。
1.2.2 试剂与仪器
本试验使用的主要仪器：分析天平(北京赛多利斯,BS224S)，干燥器(南京寿德试剂有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(海声达,DHG06200B)，恒温振荡水浴锅(Crystal,SY2230)，漩涡混合器(SI,Genie2)，低速冷冻离心机(Beckman,J6M)，激光共聚焦显微镜(上海莱瑟光谱仪器分析技术有限公司,ZEISS LSM 700)。
50 mM pH 7.0磷酸缓冲溶液(PBS，购自南京寿德试剂有限公司)，用上述PBS溶液配制300 mg/L卡尔科弗卢尔荧光增白剂染色液（购自南京寿德试剂有限公司）。
1.2.3 纤维素染色方法
分别将米糠、西兰花饲料原料、回肠样、粪便样参照DD Bear等[10]方法进行染色。步骤如下：取米糠、西兰花饲料原料、回肠样、粪样各10mg，加入10ml PBS溶液并用漩涡振荡器混匀，反复用PBS溶液冲洗并在3000rpm离心机下离心三次，加入20ml 300mg/L CW溶液混匀，恒温震荡水浴锅中放置4小时后取出，用漩涡振荡器混匀后吸取30ml悬浊液涂于载玻片上，抹匀后放入烘箱干燥，最后用激光共聚焦显微镜观察。
1.2.4 激光共聚焦显微镜观察参数设定
选择目镜10X,物镜20X或40X，分辨率为1024*1024 pixels，在单独观察纤维素时选择405nm通道，观察木质素时选择488nm激光通道，若同时观察则两通道同时打开。
试验结果
2.1 米糠观察结果
图1不同入射光源下米糠原料（R）细胞壁形态及组分分布(10x目镜，20x物镜，Bar=10μm)
注:a：卡尔科弗卢尔荧光增白剂（Calcofluor white）染色后的纤维素；b：488nm下的木质素；c：全光谱显微图；d：a、b、c融合图
。
图2不同入射光源下米糠回肠食糜样（RL）细胞壁形态及组分分布(10x目镜，40x物镜，Bar=10μm)
注:a：卡尔科弗卢尔荧光增白剂（Calcofluor white）染色后的纤维素；b：全光谱显微图；c：a、b融合图
图3不同入射光源下米糠回肠加酶食糜样（+RL）细胞壁形态及组分分布(10x目镜，40x物镜，Bar=10μm)
注:同图2
图4不同入射光源下米糠粪便食糜样（RF）细胞壁形态及组分分布(10x目镜，40x物镜，Bar=10μm)
注：同2
图3不同入射光源下米糠粪便加酶食糜样（+RF）细胞壁形态及组分分布(10x目镜，40x物镜，Bar=10μm)
目录
摘要3
关键词3
Abstract3
Key words3
引言（或绪论） 3
1材料与方法4
1.1试验材料 4
1.2试验设计 4
1.2.1试验原理4
1.2.2试剂与仪器4
1.2.3纤维素染色方法4
1.2.4 激光共聚焦显微镜参数设定4
2试验结果4
2.1米糠观察结果4
2.2西兰花观察结果7
3分析与讨论10
致谢11
参考文献11
利用激光共聚焦显微镜对米糠和西兰花茎叶粉细胞壁及其消化残渣形态的观察
引言
近年来，饲料原料价格的上涨促使养殖和饲料企业积极寻找价廉物美的替代原料。米糠俗称米皮糠或油糠，是糙米碾白过程中剥离的稻谷内种皮、糊粉层和少量碎米与胚的混合物，营养丰富，常被用作饲料原料。但因其中细胞壁组分含量较高，所以养分的消化率相对较低。我国年产稻谷2.0亿吨以上，按12%出糠率(一般在10%13%之间)计算，米糠年产可达20002500万吨，如提高其养分利用效率，可有效解决缓和饲料资 *好棒文|www.hbsrm.com +Q: &351916072&
源紧缺的局面[1]。西兰花茎叶粉是利用西兰花花球收获后地上剩余部分经打浆、压滤、烘干和粉碎制成的植物草粉。虽然总纤维高达60~70%，但粗蛋白含量可达22~25%，氨基酸配比平衡；具有浓郁的天然芳香，可改善饲料适口性。随着我国设施农业生产方式的普及和各地蔬菜基地的建设，大量西兰花等蔬菜废弃茎叶集中，已然成为一种可开发利用的非常规饲料原料资源，利用好这一资源不但可以避免粮食供给压力，而且人畜争粮矛盾亦可缓解[2]。
细胞壁是由纤维素和果胶质等多糖和蛋白质及其它成分交联构成的三维网络结构。主要成分是纤维素、半纤维素、果胶质和木质素等[3]。在米糠和西兰花茎叶粉中，因其细胞壁组分含量较高，导致养分消化率相对较低，所以研究细胞壁组分的消化代谢或许可以成为寻找替代饲料资源的一条新途径。
激光共聚焦显微镜(CLSM)是结合数字图像处理技术和激光光学技术结合而产生的一种高分辨率显微镜，显著不同于其他光学显微技术的是，其并不完全采用光学透镜的成像原理，而是采用扫描激发荧光的方式，对单点上的荧光进行检测再还原成显微图像，与传统光学显微镜相比的优势在于，它的分辨率更高，实现多重荧光同时观察并可形成清晰的三维图像等。所以自它问世已广泛应用于生物学的各个研究领域[4]。本试验利用激光共聚焦显微镜提供了上述两种纤维性饲料原料细胞壁形态和组分在猪消化过程中变化的直观图像，为细胞壁组分的消化代谢研究提供参考。
1 材料与方法
试验材料
本实验所使用的米糠和西兰花茎叶粉原料、由上述原料作为单一纤维来源配制的4种饲粮(分添加/未添加细胞壁降解酶)经生长猪消化后的回肠末端食糜和粪便样品来自于高月琴，张志静等[5]的试验。材料分为：(1)米糠原料(R)、米糠回肠食糜(RL)、米糠加酶回肠食糜样(+RL)、米糠粪便食糜样(RF)、米糠加酶粪便食糜样(+RF)，(2)西兰花原料(B)、西兰花回肠食糜样(BL)、西兰花加酶回肠食糜样(+BL)、西兰花粪便食糜样(BF)、西兰花加酶粪便食糜样(+BF)。
试验设计
1.2.1试验原理
纤维素是植物纤维原料的最主要化学成分，纤维素是由βD葡萄糖基通过1,4糖苷键联结而成的线状高分子化合物[6]。卡尔科弗卢尔荧光增白剂(Calcofluor white,CW)能与β(1→4)及β(1→3)葡聚糖结合对纤维素进行标记，利用CW受364 nm紫外线激发而发出410480 nm蓝色荧光的性质,对细胞壁内β葡聚糖进行定位[7]。
利用木质素是苯基丙烷结构单元(即C6C3单元)中所含芳香性基团能被488nm波长激光激发发射510530 nm绿色荧光[8]，对细胞壁中木质素进行定位[9]。
1.2.2 试剂与仪器
本试验使用的主要仪器：分析天平(北京赛多利斯,BS224S)，干燥器(南京寿德试剂有限公司)，电热恒温鼓风干燥箱(海声达,DHG06200B)，恒温振荡水浴锅(Crystal,SY2230)，漩涡混合器(SI,Genie2)，低速冷冻离心机(Beckman,J6M)，激光共聚焦显微镜(上海莱瑟光谱仪器分析技术有限公司,ZEISS LSM 700)。
50 mM pH 7.0磷酸缓冲溶液(PBS，购自南京寿德试剂有限公司)，用上述PBS溶液配制300 mg/L卡尔科弗卢尔荧光增白剂染色液（购自南京寿德试剂有限公司）。
1.2.3 纤维素染色方法
分别将米糠、西兰花饲料原料、回肠样、粪便样参照DD Bear等[10]方法进行染色。步骤如下：取米糠、西兰花饲料原料、回肠样、粪样各10mg，加入10ml PBS溶液并用漩涡振荡器混匀，反复用PBS溶液冲洗并在3000rpm离心机下离心三次，加入20ml 300mg/L CW溶液混匀，恒温震荡水浴锅中放置4小时后取出，用漩涡振荡器混匀后吸取30ml悬浊液涂于载玻片上，抹匀后放入烘箱干燥，最后用激光共聚焦显微镜观察。
1.2.4 激光共聚焦显微镜观察参数设定
选择目镜10X,物镜20X或40X，分辨率为1024*1024 pixels，在单独观察纤维素时选择405nm通道，观察木质素时选择488nm激光通道，若同时观察则两通道同时打开。
试验结果
2.1 米糠观察结果
图1不同入射光源下米糠原料（R）细胞壁形态及组分分布(10x目镜，20x物镜，Bar=10μm)
注:a：卡尔科弗卢尔荧光增白剂（Calcofluor white）染色后的纤维素；b：488nm下的木质素；c：全光谱显微图；d：a、b、c融合图
。
图2不同入射光源下米糠回肠食糜样（RL）细胞壁形态及组分分布(10x目镜，40x物镜，Bar=10μm)
注:a：卡尔科弗卢尔荧光增白剂（Calcofluor white）染色后的纤维素；b：全光谱显微图；c：a、b融合图
图3不同入射光源下米糠回肠加酶食糜样（+RL）细胞壁形态及组分分布(10x目镜，40x物镜，Bar=10μm)
注:同图2
图4不同入射光源下米糠粪便食糜样（RF）细胞壁形态及组分分布(10x目镜，40x物镜，Bar=10μm)
注：同2
图3不同入射光源下米糠粪便加酶食糜样（+RF）细胞壁形态及组分分布(10x目镜，40x物镜，Bar=10μm)
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